應用四極桿離子淌度飛行時間質譜進行蛋白質組學分析

高清晰數據直接分析：應用四極桿離子淌度飛行時間質譜進行非靶向蛋白質組學分析
Keith Richardson¹ , Christopher J. Hughes¹ , Arkadiusz Grzyb¹ , Dominic Helm² , Bernhard Kuster² , Jason Wildgoose¹ 

¹沃特世公司 （英國曼徹斯特） 
²慕尼黑理工大學 （德國弗賴辛）

應用優(yōu)勢

  ■ 改善蛋白質識別，增加蛋白質組覆蓋范圍

  ■ 即使在極低濃度下也能實現(xiàn)可靠鑒定

  ■ 更有效地進行LC/MS/MS分析從而加快決策過程

簡介
隨著自下而上（bottom-up）蛋白質組學分析的復雜性不斷增加，對于質譜儀的能力提出了挑戰(zhàn)，其需要生成更多的詳細信息才能滿足用戶的需要。近年來，質譜儀的速度、靈敏度和質量數準確性都有了顯著的提高，可獲得更好的數據質量、改善的肽序列標注以及更準確的鑒定結果。

隨著硬件性能的改善，我們開發(fā)出一系列新型LC/MS采集方案和碎裂機制，包括母離子發(fā)現(xiàn)（PID）方法、非信息依賴型采集（DIA）、離子淌度（IM）輔助方法以及電子轉移解離（ETD）。目前，IM主要應用于多種類型分析物的截面分析和結構分析¹，可增強DIA采集的特異性，例如HDMS^E。²

本研究中展示了一種新型的高清晰數據采集 （HD-DDA）模式在蛋白質和肽鑒定中的應用優(yōu)勢，該模式將離子淌度法結合到四極桿飛行時間質譜儀中。HD-DDA采用一種高工作周期模式，有利于決策的制定，可實現(xiàn)高靈敏度和選擇性的實驗。

實驗
使用胰蛋白酶酶切大腸桿菌和海拉細胞的胞質內容物。將溶解產物注入nanoACQUITY UPLC系統(tǒng)中，該系統(tǒng)配有ACQUITY UPLC BEH 1.7 μm，15 cm × 75 μm色譜柱并連接SYNAPT G2-Si質譜儀。采用ProteinLynx Global SERVER和/或Mascot對數據進行處理和搜索³。

結果與討論
HD-DDA的改進包括全面支持寬帶增強⁴，這可使信號提高5至10倍，并增強了決策制定邏輯，還可在MS和MS/MS模式之間切換。寬帶增強利用離子淌度分離單電荷態(tài)的產物離子，并結合推斥極同步以實現(xiàn)接近100%的工作周期，如圖1所示。

HD-DDA采集通常在非靶向模式下進行，可以由無限制的目標和/或排除列表進行補充。碰撞能量可以是階梯式的、傾斜的或基于m/z和電荷態(tài)實時確定。數據可通過ProteinLynx Global SERVER或分別使用供應商中立的搜索算法和驗證工具進行處理和搜索，例如Mascot和Scaffold⁵。

圖2中證實了寬帶增強的優(yōu)勢。其中，大腸桿菌胰蛋白酶消化物通過納升LC/MS/MC進行分析。數據采集分別采用常規(guī)DDA和HD-DDA。在這兩種情況下，均選取了LC峰內相同時間的0.1秒MS/MS數據。在該實驗中，將整個MS/MS譜圖進行平均后發(fā)現(xiàn)，信號增強了5倍。

在該實驗中，每次調查掃描執(zhí)行15次并行MS/MS實驗。如圖3所示，結果表明將DDA與HD-DDA對比時，MS/MS總離子流（TIC）的增加與MS/MS通道數呈函數關系。每次運行的平均增加量為420%，與圖2中所示結果一致。插圖是15次MS/MS通道的示例，證明了可從樣品中存在的較低豐度的肽中輕松獲取具有良好信噪比的MS/MS數據。

圖4中顯示了采用HD-DDA對相同的大腸桿菌樣品進行自下而上的LC/MS蛋白質組學實驗可增加靈敏度。A圖展示了肽序列匹配數量的增加。B圖中的維恩相交圖將蛋白質鑒定數量進行了對比。從中可觀察到鑒定的肽數量（34.8%）和蛋白質數量（42.8%）均有顯著增加。

圖5顯示了一個更具挑戰(zhàn)性的樣品的搜索結果。此處匯總了海拉細胞胰蛋白酶消化物分析的PLGS搜索結果�？偣灿�2200多種蛋白質被鑒定為超過95%的鑒定置信度閾值。在該實驗中，譜圖鑒定率為38%。

結論

  ■ HD-DDA寬帶增強通常可使信號增強5至10倍

  ■ 低豐度物質/肽的譜圖數據質量得到顯著提升

  ■ MS/MS譜圖獲得正確匹配的比例大大增加

  ■ HD-DDA數據的鑒定數量增加是靈敏度提高和譜圖質量改善的直接結果

參考文獻 
1.  Giles K. Travelling wave  ion mobility.  Int J  Ion Mobility Spectrom.  2013; 16(1):1-3.
2.  Rodriguez-Suarez  E, Hughes C, Gethings  L, Giles K, Wildgoose  J, Stapels M,  Fadgen K, Geromanos SJ, Vissers JPC,  Elortza  F,  Langridge JI. An  Ion Mobility Assisted Data  Independent  LC-MS  Strategy  for  the Analysis of Complex Biological Samples. Current  Anal Chem. 2013 April; 9(2):199-211.
3.  Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS. Probability-based  protein identi?cation by searching sequence databases using mass  spectrometry data. Electrophoresis. 1999 Dec; 20(18):3551-67.
4.  Wildgoose, et. al. A comparison of methods of improving the duty  cycle on orthogonal TOF mass analyzers. ASMS 2005.
5.  Searle BC. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based  proteomic studies. Proteomics. 2010 Mar; 10(6):1265-9.

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