使用UPLC/MS/MS分析血清中的25-羥基維生素D

Lisa J Calton, Scott D Gillingwater, Gareth W Hammond, Donald P Cooper
沃特世公司臨床業(yè)務部(英國曼徹斯特阿特拉斯商業(yè)園)

簡介
臨床研究表明：維生素D缺乏癥在世界許多地區(qū)的成人和兒童中非常普遍。除了眾所周知的影響(例如與鈣吸收障礙相關的佝僂病、骨質疏松癥和骨軟化癥)外，現(xiàn)在越來越多的證據表明維生素D缺乏癥還會增加罹患某些癌癥的風險，并對許多其它疾病有一定的影響^1,2。維生素D具有兩種存在形式，一種是皮膚暴露于日光下所產生的維生素D₃(D3) ，另一種則是存在于多種補品中的植物衍生物—維生素D₂(D2)。維生素D在肝臟中代謝形成25-羥基維生素D[25OHD]，后者在腎臟中進一步代謝形成活性代謝物1,25-二羥基維生素D。25OHD的水平被認為是評價體內維生素D水平的最佳臨床指標³。維生素D水平的評估對于維生素D缺乏癥的診斷和補充治療的監(jiān)測非常重要。最近，相對于競爭性結合檢測、免疫檢測和HPLC法等其它方法，利用LC/MS/MS方法定量分析25OHD2和25OHD3在提高檢測質量和降低成本方面，更加受到人們的青睞。免疫檢測的主要問題是無法區(qū)分25OHD2和25OHD3，還需依靠抗體與25OHD2的交叉反應才能測定25OHD的總濃度 。如果該交叉反應低于100%，那么D2治療可能無法得到準確監(jiān)測⁴。

圖1. 沃特世ACQUITY UPLC/TQD的系統(tǒng)配置

實驗
將Waters® ACQUITY® 串聯(lián)四極桿檢測器(TQD)與ACQUITY UPLC®聯(lián)用以進行各項分析。完整的系統(tǒng)配置如圖1所示。儀器通過MassLynx® 4.1軟件在電噴霧正離子模式下運行，并采用QuanLynx^TM應用軟件自動進行數據處理。對錐孔電壓進行優(yōu)化，使得進入離子源的母離子的豐度最大化，并通過第一級四極桿選擇相應的母離子進入碰撞池。利用氬氣和碰撞能量促使碰撞誘導解離，生成特征性產物離子。利用此方法建立特異的多重反應監(jiān)測(MRM) ，實驗如表1所示。

LC條件
LC系統(tǒng)： Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C₈, 2.1 x 50mm, 1.7μm
柱溫：   45 ˚C
流速：   400μL/min
流動相A： 2 mM醋酸銨+0.1%甲酸的水溶液
流動相B： 2 mM醋酸銨+0.1%甲酸的甲醇溶液
梯度： 流動相B在73%保持2 min，在1.5 min內從73%增加至98% 

MS條件
MS系統(tǒng)： Waters ACQUITY TQD
電離模式： ESI+ 
毛細管電壓： 2.5kV
錐孔電壓： 24V
脫溶劑氣溫度：400˚C  
脫溶劑氣流量：900L/h
源溫度： 120˚C
碰撞氣流速: 7.10 x 10^-3mbar

校準品和QC標準品
按照各個生產廠家的說明制備單一濃度的校準品和雙濃度水平的QC標準品(Chromsystem，德國慕尼黑)。通過混合人血清并加入已知濃度的25OHD2和25OHD3，制備低濃度QC標準品溶液。低、中和高濃度QC樣品中25OHD2的最終濃度分別為19、27和84ng/mL，25OHD3的最終濃度則分別為13、29和89ng/mL。使用哺乳動物血清制備校準品用以線性評估，其中25OHD2和25OHD3的濃度范圍為1-100ng/mL。在264 nm下檢測儲備液，然后將其調整至最終濃度。 

樣品制備
吸取血清(150μL)至2mL微量離心管(Anachem)中，加入10μL內標(250ng/mL六氘代25OHD3，合成AS，以80%甲醇/20% IPA為溶劑) ，渦旋混合(10s)。加入0.2 M ZnSO₄溶液(150μL)并渦旋混合(10s)以增強反應 。加入甲醇 (300μL)并混合(10s)，以沉淀血清中存在的蛋白質。加入己烷(750μL)，用以提取25OHD�；旌�30s，然后將樣品在13000rpm下離心5 min。移取己烷層并將其置于沃特世最大回收樣品瓶中，在50˚C的氮氣下蒸發(fā)至干。將樣品復溶于75μL70%甲醇水溶液中，借助ACQUITY樣品管理器的預加載功能將20μL樣品注入UPLC/MS/MS系統(tǒng)中，進樣間隔時間為6 min。

離子抑制
將人血清樣品混合低濃度的25OHD2和25OHD3并使用柱后添加對其進行分析，以100ng/mL濃度和10μL/min流速通過ACQUITY TQD集成式樣品流路。 

結果線性
使用QuanLynx定量軟件和ApexTrack^TM積分算法進行數據處理 。以2.5-100ng/mL的濃度范圍內向血清中加入已知濃度的25OHD2和25OHD3，對分析方法的線性進行考察。25OHD3的確定系數(R2)>0.999(圖2)，計算所得的校準品濃度均在指定值的±4%范圍之內。 25OHD2的確定系數(R2)>0.997(圖3) ，計算所得的校準品濃度均在指定值的±10%范圍之內。

圖2 .血清中25OHD3的校準曲線。

圖3 .血清中25(OH)D2的校準曲線。 

準確度
通過分析購自DEQAS(www.deqas.org)的外部質量控制樣品考察分析方法的準確性。利用Chromsystem單點校準品繪制出一條過零點的校準曲線，用以計算DEQAS樣品濃度。采用Passing-Bablok線性回歸(Microsoft Office Excel 2003，帶Analyse-It插件1.73版)將Waters 25OHD3的結果與通過DEQAS LC/MS方法所得的結果平均值進行對比。所有結果均在預期值的±11.5%偏差范圍之內(圖4)。

圖4 .將Waters 25OHD3結果與DEQAS LC/MS方法所得的結果平均值進行對比的Passing-Bablok線性回歸分析。

精度
通過提取低 、中和高濃度的QC樣品并重復分析5次以測定批內精度。根據這三個濃度水平計算25OHD的變異系數(CV) 。對低 、中和高濃度的QC樣品進行連續(xù)5天的分析，測定批間精度。結果如表2所示。

靈敏度
提取所得的最低濃度內部血清校準品的色譜圖如圖5所示。各色譜圖標記了化合物名稱、峰間信噪比(SNR)和濃度。所有響應均高于檢測限(SNR 5:1)，因此，本方法可檢出維生素D嚴重缺乏癥患者的維生素D水平(<6ng/mL)。

圖5 .色譜圖顯示了最低濃度校準品和各個分析物的信噪比測定結果。

離子抑制
離子抑制研究表明25OHD3在離子抑制區(qū)域部分洗脫，如圖6所示。

圖6 .25OHD離子抑制分析，通過放大視圖顯示了25OHD2和25OHD3的洗脫分析結果。

需使用一種穩(wěn)定同位素標記內標物來補償所觀測到的各個分析物之間的基質效應差異⁵ 。

討論
本文中開發(fā)了一種利用UPLC/MS/MS分析血清中25OHD2和25OHD3的方法。該方法通過從血清中進行液-液萃取以及利用定性和定量離子進行各個分析物定量檢測。此外，通過監(jiān)測定性離子比率提高了準確識別分析物的可靠性。測定結果表明，本方法具有良好的靈敏度以及批內和批間精密度。采用本方法，可以每天分析多達100個樣品。 

結論
本文中開發(fā)的分析血清中25OHD2和25OHD3的方法具有良好的線性、靈敏度和精度。本方法與傳統(tǒng)的免疫測定法相比，可提供更加可靠的結果。

UPLC/MS/MS能夠準確可靠地測定血清中的250HD2和250HD3，防止誤報接受D2補充治療的患者體內的維生素D總體濃度。 

參考文獻
1.  Gorham ED, Garland CF, Garland FC, Grant WB, Mohr SB, Lipkin M, et al. Optimal vitamin D status for colorectal cancer prevention: a quantitative meta-analysis. Am J Prev Med 2007;32:210–6.
2.  Garland CF, Gorham ED, Mohr SB, Grant WB, Giovannucci EL, Lipkin M, et al. Vitamin D and prevention of breast cancer: pooled analysis. J Steroid Biochem Mol Biol 2007;103:708–11.
3. Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes Institute of Medicine. DRI Dietary Reference Intakes for calcium phosphorus, magnesium, vitamin D and fluoride. National Academy Press,Washington,DC; 1997.
4.  Hollis B. Editorial: The Determination of Circulating 25-Hydroxyvitamin D: No Easy Task. J Clin Endocrinol Metab, July 2004,89(7):3149–3151.
5.  Viswanathan CT. et al. Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays. Pharmaceutical Research 2007;24(10):1962-1973.