細胞凋亡，細胞凋亡通路和細胞凋亡檢測的幾種檢測方法

一、形態(tài)學(xué)觀察方法

1、HE染色、光鏡觀察：細胞凋亡后呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團塊狀，細胞表面有“出芽”現(xiàn)象。

2、丫啶橙(AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。細胞凋亡|后（細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3、臺盼藍染色：（細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區(qū)別壞死細胞有一定的幫助。

4、透射電鏡觀察：（細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。

二、dna凝膠電泳

(一)、檢測原理（細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）

細胞發(fā)生凋亡或壞死，其細胞DNA均發(fā)生斷裂，細胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但細胞凋亡后DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180-200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區(qū)別。

(二) 細胞凋亡，結(jié)果判斷

正常活細胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀(LADDER)條帶; （細胞凋亡）后，壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶。

三、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測定（細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）

細胞凋亡的DNA斷裂使細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測，細胞凋亡。

(一) （細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）檢測步驟

1、細胞凋亡后，將其裂解后高速離心，其上清液中含有核小體

2、在微定量板上吸附組蛋白體

3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合

4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合

4、加酶的底物，測光吸收制。

(二) （細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）用途

該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞。可用于人、大鼠、小鼠的（細胞凋亡）檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定細胞凋亡發(fā)生的絕多對量。

四、流式細胞儀定量分析（細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）

(一) （細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）檢測原理

細胞凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。

(二) （細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測）應(yīng)用價值

流式細胞儀檢測具有以下特點：

1)、檢測的細胞數(shù)量大，因此其反映群體細胞凋亡狀態(tài)比較準確

2)、可以做許多相關(guān)性分析

3)、結(jié)合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定細胞凋亡所處的細胞周期

檢測形態(tài)學(xué)及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法檢測（細胞凋亡）

細胞凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。

利用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現(xiàn)強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶(PI)而呈強的紅色熒光。

DNA片斷原位標記法

細胞凋亡后DNA片斷原位末端檢測技術(shù)是指在細胞(或組織)結(jié)構(gòu)保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)相反應(yīng)與凋亡細胞裂解后3·的羥基(-OH)端結(jié)合，經(jīng)顯色反應(yīng)后檢測DNA裂解點的技術(shù)。

DNA片段原位標記法檢測（細胞凋亡）有二種：

1、原位缺口轉(zhuǎn)移(in situ nick-translation,ISNT)技術(shù)，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·-OH端

2、原位缺口末端標記技術(shù)(in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法檢測（細胞凋亡,細胞凋亡通路，細胞凋亡檢測），它是利用TdT將標記的DUPT接到3·-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠高于ISNT，尤其對早期細胞凋亡的檢測，TUNEL更為合適。

檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯(lián)合PI法

1、TUNEL檢測（細胞凋亡）原理：在細胞凋亡早期位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至細胞膜外測。磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它于PS具有高度的結(jié)合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂酰絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標記上熒光素(如異硫氰酸熒光素FITC)，同時結(jié)合使用PI拒染法(因壞死細胞PS亦暴露于細胞膜外測，且對PI高染)進行凋亡細胞雙染法后用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。

2、TUNEL檢測（細胞凋亡）結(jié)果判斷：正�；罴毎鸄nnexin V 、PI均低染;凋亡細胞Annexin V高染、PI低染;壞死細胞Annexin V/PI均高染。

3、TUNEL檢測（細胞凋亡）應(yīng)用價值：細胞凋亡時，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時，結(jié)果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。