激光掃描影像系統(tǒng)在3D腫瘤球體或干細胞克隆球體快速檢測和分析中的應用

    發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物的研究目前正面臨著重要的挑戰(zhàn)，因為在臨床前研究顯示有效果的化合物只有5％的能繼續(xù)被開發(fā)，成為獲得許可的藥物。傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)模型在藥物發(fā)現(xiàn)過程的早期階段被用于評估候選藥物，然而，有越來越多的證據(jù)表明，在二維單層生長的細胞并不能準確地反映腫瘤的生物學復雜性。

 

    對兼容高通量篩選的更好的體外模型的需求引導了3D細胞培養(yǎng)模型的發(fā)展，尤其是多細胞微球，其將保留腫瘤的許多形態(tài)學和遺傳性狀。在體外實驗中，3D培養(yǎng)模型被廣泛地認為相比2D形式的培養(yǎng)系統(tǒng)是更加具有生理相關性的模型。3D模型更加準確地反映了體內微環(huán)境中的復雜性，并被用于許多的研究領域，比如腫瘤學[1]，肝臟毒性[2]，神經(jīng)生物學[3]，胰腺研究[4]，腎臟學[5]，以及干細胞研究[6]。這些研究顛覆了我們對體外培養(yǎng)中以及體內的細胞行為學的認識。然而，由于細胞培養(yǎng)技術的限制，以3D培養(yǎng)系統(tǒng)進行高通量篩選卻發(fā)展地非常緩慢。技術瓶頸包括實驗的異質性、低通量、難以實現(xiàn)自動化以及昂貴的成本。

 

        在這里，我們描述通過兩種方法進行3D培養(yǎng)的細胞球體檢測：1）在超低附著板中；2）在半固體瓊脂上。這兩種方法都可在96和384孔微孔板形式上進行。

 

    我們隨后用Acumen hci激光掃描技術進行快速的整板圖像采集（5分鐘/塊），給出一系列參數(shù)，例如球體的數(shù)量、面積和體積。Acumen hci是適于對微球體進行高內涵分析的完美系統(tǒng)，它獨有的全孔掃描能力可一次采集單孔中不同位置所有微球體的信息，而具有一定景深的掃描鏡使得可對孔中處于各層的球體也一次捕獲，對單個球體體積進行統(tǒng)計而無需對其進行Z層斷層掃描，多次采集數(shù)據(jù)。

 

 

A：   在超低粘附板中形成腫瘤微球體

Corining的超低粘附板，采用不透明的壁和清晰、圓形的孔底。專有的超低細胞粘附涂層，具有親水性、生物惰性的和不可降解的特性，通過共價連接到孔底部的內表面上。這種對培養(yǎng)孔底部獨特的設計，使3D細胞球體培養(yǎng)物可高度可重復地生長。不透明的側壁和專有板底網(wǎng)格形式的設計大大降低了熒光、冷光背景和孔與孔之間的串擾。在孔中，球狀體可以生成，培養(yǎng)，并進行熒光或者冷光信號的檢測，而無需將球狀體轉移。目前，Corning超低粘附板具有96孔和384孔板形式，這兩種板型都很方便進行自動化。   a) 將懸浮于完全培養(yǎng)基中的肝癌細胞株HepG2的單細胞鋪板于Corning超低粘附板中（#4520&3830），鋪板密度為96孔板每孔200μl含有300個細胞，384孔板中每孔50μl含有300個細胞 b) 在24小時內，懸浮的細胞將組裝成單個3D微球，沉淀在細胞中央，如右圖Figure1A所示 c) 72小時后，將50%的培養(yǎng)基更換成含有2倍濃度的Doxorubicin（阿霉素）的新鮮培養(yǎng)基，更換后終濃度為316pM~3.16μM d) 形成的微球體繼續(xù)培養(yǎng)6天

Figure 1A

 

	96孔板	384孔板	Figure 1B
基底層（含0.6%瓊脂的培養(yǎng)基）	25μl	10μl
細胞層（含0.4%瓊脂的單細胞懸液）	50μl含有500個細胞	20μl含有150個細胞
培養(yǎng)基覆蓋層	75μl	30μl
a) 按照以上體系進行軟瓊脂的配制 b) 將含有單細胞的軟瓊脂培養(yǎng)于37度培養(yǎng)箱 c) 24小時后，將5μl的Doxorubicin（阿霉素）加入孔中，終濃度為1nM~1μM d) 繼續(xù)培養(yǎng)微球體4天，3天更換一次含有阿霉素的覆蓋層培養(yǎng)基

 

C：染色和圖像采集

a) 在含有細胞微球的孔中加入染料Calcein-AM（終濃度為5μM）對兩種方法形成的腫瘤微球體進行染色，染料加入后在37度孵育1小時 b) 板子隨后用Acumen進行圖像采集（每板的圖像采集和數(shù)據(jù)輸出需要5分鐘） c) 數(shù)據(jù)是在線分析的，在掃描圖像的同時即獲得了，得出的報告含有球體的數(shù)量、面積和體積、熒光強度等等信息

Figure 1C

                                          

A          96孔板
	Figure 2A: 生長在96孔超低粘附板中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像底部顯示了加入每孔的阿霉素濃度。2B-C：藥物量效曲線（mean±SEM，n=6）
B	C

 

A          384孔板
	Figure 3A:生長在384孔超低粘附板中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像底部顯示了加入每孔的阿霉素濃度。3B-C：藥物量效曲線（mean±SEM，n=8）
B	C

 

 

A	B	C
	D
		Figure 4A: 生長在96孔板軟瓊脂中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像上顯示了加入每孔的阿霉素濃度。4B-D：藥物量效曲線（mean±SEM，n=3）

 

A	B	C
	D
		Figure 5A: 生長在384孔板軟瓊脂中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像上顯示了加入每孔的阿霉素濃度。5B-D：藥物量效曲線（mean±SEM，n=4）

 

 

        生長在 3D培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞群體、不同細胞類型、微組織結構相互協(xié)調、相互作用，模擬了生命物質在體內微環(huán)境中的真實生存環(huán)境，為研究者對疾病的剖析和攻克提供了高質量的數(shù)據(jù)信息。我們在96和384微孔板中建立了兩種簡單且穩(wěn)定的進行腫瘤微球體3D培養(yǎng)的方法，通過染色和圖像采集，獲得數(shù)目、面積、體積和熒光強度等信息。藥物量效曲線的一致性結果體現(xiàn)了兩種方法的可靠性和可重復性，這些數(shù)據(jù)表明acumen hci激光掃描系統(tǒng)是對基于兩種培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的腫瘤微球體進行高通量（5分鐘/板）分析的理想平臺，該平臺在過去的研究中已經(jīng)被廣泛地應用于腫瘤學[7-9]和干細胞研究領域[10-12]。

 

 

1. Maria V, Sharon G, Frances B, et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology, 2012, 10:29

 

2. Patricio G, Nicola J H, Ute A, et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Arch. Toxicol, 2013, 87(8): 1315-1530

 

3. Yinzhi L, Amish A, Ke Ch, et al. Neural Cell 3D Microtissue Formation is Marked by Cytokines’ Up-Regulation. PLoS One, 2011, 6(10): e26821

 

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5. Anna I A, Brenda K M, Glen D P, et al. A 3-D organoid kidney culture model engineered for high-throughput nephrotoxicity assays. Biomaterials, 2012, 33(18): 4700-4711

 

6. Sasai Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell, 2013, 12(5): 520-530

 

7. Weijuan W, Chen Bi, Kelly M C, et al. Inhibition of tumor growth and metastasis in non-small cell lung cancer by LY2801653, an inhibitor of several oncokinases, including MET. Clin Cancer Res, 2013, 19(20): 5699–5710

 

8. Kai W, Ho Y L, Shephanie S, et al. Genomic Landscape of Copy Number Aberrations Enables the Identification of Oncogenic Drivers in Hepatocellular Carcinoma. Hepatology, 2013, 58(2): 706-717

 

9. Shane R H, Jeremy T, Anthony P O, et al. An HTS-Compatible 3D Colony Formation Assay to Identify Tumor-Specific Chemotherapeutics. J Biomol Screening, 2013, 18(10): 1298-1308

 

10. Koppany V, Hydeyuki O, Robert D, et al. A molecular screening approach to identify and characterize Inhibitors of glioblastoma stem cells. Mol Cancer Ther, 10(10), 1818-1828

 

11. Anne D, Jimmy E, Richard J S, et al. CXCR4 Expression in Prostate Cancer Progenitor Cells. PLoS One, 2012, 7(2): e31226

 

12. Claudia P, Ina K, Leoni K. Discovery of the cancer stem cell related determinants of radioresistance. Radiother Oncol, 2013, 108(3), 378-387