Real-time PCR 數(shù)據(jù)導出 —— ABI儀器篇
瀏覽次數(shù):4401 發(fā)布日期:2015-3-2
來源:BioTNT
1. Real-time PCR數(shù)據(jù):Real-time PCR完成后,所有數(shù)據(jù)并非可以直接導出,由于每一次實驗的情況都不相同,儀器的很多默認設(shè)定都會對最終數(shù)據(jù)結(jié)果造成重大偏差,所以在完成PCR過程后,需要人為對實驗結(jié)果進行條件設(shè)置,才能提取到科學有效的實驗結(jié)果,進而完成對實驗結(jié)果的分析和判斷。
2. 數(shù)據(jù)導出調(diào)整步驟:a調(diào)整參比熒光選項;b調(diào)整基線;c調(diào)整閾值
3. 概念:
a.參比熒光(dye as the passive reference):參比熒光的作用是用來消除光程差,調(diào)整擴增曲線線形和溶解曲線峰形,與PCR反應(yīng)所加熒光染料mix相關(guān),不同公司品牌的mix所含參比熒光的種類不一樣,如:Takara選用ROX,ABI則沒有參比熒光,數(shù)據(jù)提取時,需注意下參比熒光選項,如選錯,擴增曲線或溶解曲線或?qū)o法正確呈現(xiàn)。
b.基線(Baseline):是指在PCR擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里,熒光信號變化不大。接近一條直線,這樣的直線即是基線;調(diào)整包括基線起點與基線重點,起點一般設(shè)在2-3個CT,終點設(shè)在擴增曲線開始上揚即進入指數(shù)增長期的CT值前2-3個CT,終點設(shè)置太靠前會降低CT值,太靠后則會增加CT值。如儀器默認基線期與上述基準不一致,很可能需要人為設(shè)定調(diào)整。
c.熒光域值(threshold):一般儀器會將PCR 反應(yīng)前15個循環(huán)(即基線期)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值默認是PCR 3-15個循環(huán)熒光信號標準差的10倍,正確的熒光域值應(yīng)設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期循環(huán)數(shù)。
4. StepOne參比熒光: 在plate setup中選擇和設(shè)置參比熒光
5. StepOne基線(Baseline):選中Analysis Setting按鈕,出現(xiàn)如下對話框
• 選中Advanced Setting選項,將每個差別大Baseline End值調(diào)到正確數(shù)值。
• 最后點擊Apply Analysis Setting按鈕
• 左圖調(diào)整前基線微上翹,有圖調(diào)整后基線平整
• 6. StepOne閾值(Threshold):選中孔板中所有的數(shù)值,如下界面選擇log、Target對話框
• 將每個基因的Tredshold Auto勾選掉,閾值數(shù)值調(diào)整范圍原則在指數(shù)增長期。
閾值數(shù)值調(diào)整范圍原則在指數(shù)增長期,該范圍中,曲線斜率相同,ΔCT值不變
• 注意同一板結(jié)果所有內(nèi)參目的基因閾值設(shè)定需一致,這樣的ΔCT有可比性。