靶向FGFR3胞外區(qū)域的人scFv抗體的篩選和活性研究

 

成纖維細胞生長因子(FGF)是最大的一類中胚層和上皮細胞生長分化多肽因子家族。FGFs在許多生物學過程中發(fā)揮重要作用，比如胚胎發(fā)育，傷口愈合，血細胞生成及血管發(fā)生等。此外，已有研究表明FGFs可以增加多種腫瘤細胞的浸潤性，如前列腺、膀胱、腎臟、乳房、胰腺等部位腫瘤。

目前，共發(fā)現(xiàn)20多種FGFs，對不同類型細胞具有不同的作用。但是，只發(fā)現(xiàn)了5種FGF受體(FGFR)。在蛋白水平上，這些受體具有55%-72%的同源性。FGFR結構包括一個胞外配體結合區(qū)域，一個跨膜區(qū)域以及一個胞內激酶區(qū)域。配體結合區(qū)域包含三個不同的類似免疫球蛋白結構域(稱為免疫球蛋白I，II和III)。FGFR1-3 mRNA的不同的剪接作用形成兩種亞型α和β。其中FGFR3具有兩種不同的突變體IIIb和IIIc。這兩種變體具有不同的親和活性：IIIc分布更加廣泛，能和多種FGFs結合(FGF1，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF4，和FGF9)；IIIb優(yōu)先和FGF1結合，能夠較低程度和FGF8和FGF9結合。在有肝素(heparin)作用的情況下，F(xiàn)GFs和FGFRs結合后，F(xiàn)GFs誘導受體二聚化，引起胞內激酶區(qū)域的自身磷酸化以及下游信號級聯(lián)反應的激活。配體受體結合后，F(xiàn)GFs會啟動多種信號轉導途徑：胞內鈣離子水平升高，誘導絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C通路，激活腺苷酸環(huán)化酶以及誘導原癌基因c-myc 和c- fos。

已發(fā)現(xiàn)FGFR3會發(fā)生特殊突變，導致其酪氨酸激酶活性激活，引起一些與骨骼發(fā)育，多發(fā)性骨髓瘤，頸部腫瘤以及膀胱腫瘤相關的綜合征。最近的研究發(fā)現(xiàn)FGFR信號是前列腺腫瘤細胞在體外存活所完全必需的。近來，F(xiàn)GFR3已被作為多發(fā)性骨髓瘤的可能治療性靶點。盡管已有確實證據(jù)表明激活的FGFR3突變存在于腫瘤組織中，但是關于FGFR3在腫瘤組織中的表達知道的非常少。近來，使用基因芯片技術對基因表達分析后，發(fā)現(xiàn)和正常組織相比FGFR3在膀胱腫瘤樣品中過表達。基因表達水平通過Western blot和免疫組化分析在蛋白水平上進一步確證。事實上，這種蛋白的過量產生在過渡性腫瘤中似乎比基因突變更容易發(fā)生。所有這些數(shù)據(jù)都表明FGFR3可能是一個非常有吸引力的泌尿外科腫瘤的治療性靶點。膀胱腫瘤是生殖泌尿系統(tǒng)第二個最常見的惡性腫瘤之一。大約40%-50%的膀胱腫瘤表現(xiàn)出FGFR3基因發(fā)生突變；表皮腫瘤發(fā)生的概率(80%)比浸潤性腫瘤更大。

隨著人們對FGFR3作為不同腫瘤治療性靶點的興趣越來越大，以及進來發(fā)現(xiàn)它在過渡細胞瘤中的過度表達，我們已開始使用噬菌體展示技術開發(fā)用于治療的人源抗體。噬菌體抗體展示是目前最好的一個開發(fā)用于研究，臨床以及治療用途人源抗體的方法。但是，對于抗體開發(fā)來說，F(xiàn)GFR3分子非常難以琢磨，因為小鼠和人的FGFR3同源性非常高(92%)。僅最近，有報道通過使用一個庫容非常大(2.1*1010)的商業(yè)化Fab庫，開發(fā)出針對一個FGFR3亞型的Fab片段。在我們的試驗中，我們使用了兩個公開的scFv抗體庫Tomlinson I + J (MRCGeneservices, Cambridge, United Kingdom)。兩個庫的庫容都大概在1.4*108。scFvs相比IgG以及Fabs具有更好的腫瘤浸潤性，能夠更快速被清除，同時具有更好的特異性。在這篇報道中，我們已經篩選出了一些對FGFR3a的亞型IIIc具有特異性的人scFv抗體。這些抗體通過FACS證明可以和膀胱腫瘤細胞系RT112發(fā)生反應，并且抑制細胞增殖，具有進一步用于治療的潛力。

 

RT112，HEK293；重組人FGFR3a（IIIc）/Fc，F(xiàn)GFR1a（IIIc）/Fc，F(xiàn)GF9，F(xiàn)GF1以及表皮生長因子。鼠抗人FGFR3單克隆抗體，羊抗人IgG（Fc特異性），鼠抗c-myc單克隆抗體，微管蛋白抑制劑；HRP-抗c-myc抗體，抗6His抗體，抗M13抗體，HRP-抗M13單克隆抗體，F(xiàn)ITC-兔抗鼠IgG，R-藻紅蛋白羊抗鼠IgG，鼠IgG TrueBlot。

 

FGFR3的胞外區(qū)域和人IgG的Fc C端融合表達，構建表達載體pcDNA3.1-FGFR3(IIIc)WT-Fc和pcDNA3.1-FGFR3(IIIc)S249C-Fc。然后，轉染HEK293T細胞。免疫印跡法和FACS檢測蛋白表達和活性。

 

人scFv噬菌體庫Tomlin-son I + J，輔助噬菌體KM13，E.coli TG1和HB2151。分別單獨培養(yǎng)兩個噬菌體庫，然后1:1混合噬菌體用于篩選。按照示意圖1所示，進行噬菌體庫篩選和scFv表達。第一輪篩選，使用1ug FGFR3或人IgG蛋白包被微孔板。噬菌體先和人IgG孵育1小時去除可以和Fc發(fā)生反應的噬菌體；再和FGFR3包被的孔孵育2小時。最后，微孔板使用0.1%PBST洗滌10遍(下一輪篩選洗滌20遍)，使用100ul胰蛋白酶處理微孔板，洗脫結合的噬菌體。洗脫獲得的噬菌體按照Goletz等描述的方法進行另一輪的淘選。

 

圖1：噬菌體庫篩選FGFR3特異性scFv抗體流程圖

 

使用0.3ug的FGFR3，F(xiàn)GFR1或者人IgG蛋白包被微孔板，洗滌，封閉，加入不同濃度前面篩選純化后的噬菌體懸浮液。孵育后，加入HRP-抗M13抗體，加入底物顯色，450nm讀取結果。

 

經過兩輪或三輪的篩選后收獲的噬菌體經過培養(yǎng)生長出克隆，然后使用QPix高通量自動化克隆篩選系統(tǒng)(Molecular Devices)挑取單克隆到含有100ul 2TY培養(yǎng)基的96微孔板，37度培養(yǎng)，第二天使用相同培養(yǎng)基對培養(yǎng)物1:100稀釋，然后37度震蕩培養(yǎng)2小時，加入25ul含有109輔助噬菌體KM13的2TY培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1小時。菌體經過離心，重懸于2TY培養(yǎng)基，30度過夜培養(yǎng)。最后，離心，取50ul上清，進行單克隆噬菌體ELISA分析。

 

獲得的高特異性克隆，使用E.coli HB2151誘導表達，離心收獲菌體，提取細菌周質腔蛋白，最后使用親和色譜純化。純化的各組分使用SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色分析。純化的組分進一步使用分子篩層析分離出scFv蛋白的單體(scFv容易發(fā)生二聚體或者多聚體)。

 

使用BiacoreX分析可溶性scFv和FGFR3的結合動力學，并且計算獲得每個純化的scFv的Kd值；使用競爭性結合分析確定每個scFv的特異性結合位點。使用同樣的方法分析scFvs和FGF9，F(xiàn)GF1以及EGF是否能競爭結合FGFR3。

 

使用流失細胞儀分析噬菌體scFv和純化后可溶性scFv在細胞水平上和FGFR3的結合活性。通過處理RT112細胞，然后使用共聚焦顯微鏡進一步分析抗體結合活性。

 

使用不同濃度的抗FGFR3 scFvs抗體(0.02-2umol/L)處理RT-112細胞，48小時后，使用MTT對細胞進行染色，然后570nm讀數(shù)。細胞活力通過下面公式計算：Abs-scFv處理的細胞/Abs-對照組細胞。

 

篩選FGFR3特異性scFv抗體：如表1所示，總共隨機挑選了288個克隆，通過ELISA檢測，獲得15個FGFR3特異性的抗體克隆。通過測序發(fā)現(xiàn)，15個克隆里面有6個克隆的序列是唯一的。3A和1D序列內部有一個終止密碼子，只在VL的CDR2區(qū)有一個堿基突變。其他4個克隆的序列有比較大的區(qū)別，主要區(qū)別集中在CDR2和CDR3。其中CDR3在VH和VL都是高度可變的，CDR2的突變主要集中在VH。

 

ELISA特異性鑒定發(fā)現(xiàn)：如圖2所示，盡管FGFR1和FGFR3具有高度同源性(>62%)，6個篩選到的scFv克隆都對FGFR3具有顯著的結合特異性；相反和FGFR1的結合活性非常弱，和陰性對照人IgG的反應結果類似。

圖2：ELISA檢測篩選到的可溶性scFvs結合特異性。從培養(yǎng)上清中獲得的scFv-pIII融合蛋白，通過ELISA方法檢測和FGFR3-Fc(黑色)，F(xiàn)GFR1-Fc(灰色)以及陰性對照人IgG(白色)的結合活性。

 

使用Biacore分析了純化后單體scFv抗體和FGFR3的親和力。如表2所示，檢測了不同scFvs的Kon，Koff以及Kd值。Kd值在40.9和12.4nmol/L之間變化，表明篩選到的scFv具有中等到較高的親和活性。如果考慮了使用的噬菌體的庫容只有1.6*108，屬于中等大小庫容，這個結果已經非常好了。

 

scFv抗體對RT112細胞表達的FGFR3的活性：使用FACS檢測了scFvs和膀胱癌RT112細胞表達的天然FGFR3蛋白的結合活性。如圖3A所以，首先檢測了6個scFvs噬菌體克隆，6個克隆都可以和膀胱癌RT112細胞發(fā)生顯著的反應。然后，檢測純化后的4個scFvs蛋白(3B，3C，2D，7D)的結合活性，發(fā)現(xiàn)3C和7D可以和RT112細胞發(fā)生顯著的反應，2D和3B的反應活性相對較弱。使用共聚焦顯微鏡觀察了3C和7D染色的細胞，進一步顯示出scFv的膜蛋白染色特征(圖3A)。

通過在非變性條件下的免疫沉淀方法進一步證明scFv和FGFR3的親和特異性。如圖3B所示，純化后的兩個scFv（3C和7D）都在正確的位置產生顯著的蛋白條件，進一步證明這兩個scFv抗體可以識別可溶性的和天然的FGFR3受體。

 

scFv抗體和FGFR3突變體的反應活性：因為FGFR3在膀胱癌細胞中經常發(fā)生突變，所以，也檢測了兩個scFv抗體和FGFR3 S249C突變體的結合活性，已有報道FGFR3 S249C是在膀胱癌細胞中最經常發(fā)生的突變形式。通過PCR方法在FGFR3中引入上面的突變，并通過DNA測序證明突變位點正確(如圖4A)。通過western bolt驗證轉染的HEK293T細胞可以正確表達突變的FGFR3S249C蛋白(如圖4B)，并且FGFR3S249C具有和野生型FGFR3WT相類似的表達水平。FACS分析證明兩個scFvs 3C和7D都可以識別表達了突變FGFR3蛋白的HEK293T細胞，甚至比表達野生型FGFR3蛋白的細胞的反應活性更強(圖4C)。

 

抑制RT112細胞增殖：我們檢測了scFvs在體外抑制RT112腫瘤細胞增殖的有效性。加入三個不同濃度的scFv到RT112細胞，如圖5A所示，兩個scFv 3C和7D都能夠顯著抑制細胞增殖，而且抑制效應和加入的抗體濃度成正相關。2umol/L濃度的時候，抑制活性最強，但是在0.2umol/L的時候，仍然具有顯著的抑制活性。

除此之外，檢測了不同的生長因子對scFvs抑制效應的影響。如圖5B所示，scFvs的抑制效應具有蛋白因子特異性。3C和7D都可以抑制由FGF9誘導的增殖，但是，只有7D能夠抑制FGF1誘導的增殖。兩個scFvs抗體都不能抑制EGF誘導的細胞增殖，此外，加入可溶性的FGFR3蛋白，可以掩蓋掉scFv的抑制效果。從形態(tài)學上看，3C和7D處理后，細胞形態(tài)會發(fā)生變化，尤其是7D處理后能明顯導致細胞空泡形成(圖5C)。

 

圖3.FACS和共聚焦顯微鏡分析噬菌體、可溶性scFvs蛋白和RT112膀胱癌細胞的結合活性。A. FACS 直方圖顯示每個scFv克隆的結合活性(粗線)以及背景熒光(灰色)。RT112細胞使用3C 和7D scFvs標記，使用FITC熒光抗體以及DAPI染色細胞。激光共聚焦顯微鏡下成像顯示(綠色)scFvs蛋白結合細胞膜，(紅色)DAPI染色細胞核區(qū)域。B. RT112細胞裂解液FGFR3 IP分析。A.RT112細胞裂解液；B. 陰性對照；C, scFv3C；D, scFv7D。

 

圖4.篩選到的scFvs和FGFR3突變體胞外區(qū)域的反應活性。A.測序顯示DNA序列中引入突變：Ser(TCC)249 突變?yōu)镃ys (TGC)。B. 免疫印跡分析證明野生型FGFR3和突變FGFR3 (S249C) 在HEK293T細胞中的表達。C . F A C S 分析s c F v 蛋白和表達野生型FGFR3及突變FGFR3 (S249C) HEK293T細胞的結合活性。柱狀圖中：灰色表示陰性對照；黑色線表示FGFR3(IIIc)WT ；虛線表示FGFR3(IIIc)S249C。

 

圖5. FGFR3特異性的scfvs抗體對RT112細胞增殖的抑制。A. 不同濃度的3B, 3C, 2D和7D scFvs抗體對RT112細胞的抑制活性。C. 2 umol/L 3C and 7DscFvs處理細胞后，細胞數(shù)目和形態(tài)的分析。

 

FGFR3是一個受體酪氨酸激酶，通過激活不同的信號通路在細胞生長和腫瘤形成過程中發(fā)揮作用。除了膀胱癌，F(xiàn)GFR3在許多類型腫瘤中發(fā)生突變和過表達，所以FGFR3能作為一個優(yōu)秀的有效的治療的腫瘤靶點。以前的研究表明，可溶性的天然FGFR3的胞外配體結合區(qū)域具有抑制細胞增殖的效應，原理就是可以競爭結合配體，減少配體和細胞表面受體結合�？贵w片段可能模仿類似的機制來抑制細胞增殖，事實上，許多研究已經表明，3C和7D能夠抑制RT112細胞增殖的機理就是抗體片段直接阻止了FGF-FGFR3的相互作用，從而抑制了FGFR3的激活。但是3C和7D結合FGFR3后的解離速度太快(即Koff值太高約

1.22*10-2和6.14*10-2)，Koff的減少，意味著Kd值的增加，即抗體親和力增加。所以，可以以3C和7D scFv的序列為模板，在此基礎上通過CDR區(qū)突變或者體細胞突變模仿來進行親和力成熟。

 

1. Jorge Martínez-Torrecuadrada, Gabriela Cifuentes, Paula López-Serra, et al., Targeting the Extracellular Domain of Fibroblast Growth Factor Receptor 3 with Human Single-Chain Fv Antibodies Inhibits Bladder Carcinoma Cell Line Proliferation. Clin Cancer Res 2005;11:6280-6290.