MD使用CloneSelect Imager系統(tǒng)在半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行單克隆驗(yàn)證

優(yōu)勢(shì) · 快速成像，高效鑒定單克隆細(xì)胞系 · 準(zhǔn)確追蹤單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng) · 可以在半固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞成像，實(shí)驗(yàn)方案靈活選擇

生物藥品審批的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)一直都在不斷變化。其中用于細(xì)胞系單克隆來(lái)源的監(jiān)管條例驅(qū)使我們要在生物藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中使用更有效的技術(shù)或方法。許多研究人員通常使用成像系統(tǒng)（如CloneSelect Imager）在液體培養(yǎng)基中驗(yàn)證單克隆和監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)。其實(shí)，CloneSelect Imager系統(tǒng)也可以在半固體培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中的位置比較固定，使研究人員可以更加準(zhǔn)確地在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)同一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成像。

 

實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法通常使用有限稀釋進(jìn)行細(xì)胞克隆。但是，這種方法使用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，使追蹤細(xì)胞變得比較困難或不夠準(zhǔn)確。因?yàn)樵谔幚砦⒖装宓倪^(guò)程中，懸浮細(xì)胞容易在孔內(nèi)發(fā)生位置移動(dòng)（Figure 1）。不能確保不同時(shí)間點(diǎn)成像的 是同一個(gè)細(xì)胞，從而大大降低單克隆驗(yàn)證的準(zhǔn)確性。此外，有限稀釋有可能在一個(gè)孔內(nèi)加入多個(gè)細(xì)胞，需要進(jìn)行額外多次亞克隆來(lái)提高單克隆的概率。

 

使用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞給科研人員提供了一個(gè)更快更簡(jiǎn)單的克隆方法，而且有利于追蹤細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中的位置相對(duì)固定，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中細(xì)胞位置不會(huì)移動(dòng)，可以生長(zhǎng)成獨(dú)立單個(gè)的細(xì)胞克隆。所以，可以在同一個(gè)孔內(nèi)種植多個(gè)細(xì)胞，而且通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)成像，能夠清晰追蹤單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，提供單克隆的數(shù)字驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

 

CloneSelect Imager為研究人員提供了一個(gè)在半固體培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像的方法。這個(gè)系統(tǒng)使用非侵入性檢測(cè)方法，無(wú)需標(biāo)記細(xì)胞直接進(jìn)行成像，可以對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行準(zhǔn)確定量；進(jìn)行單細(xì)胞來(lái)源克隆驗(yàn)證，確保只選擇穩(wěn)定的單克隆用于下游研究。本文通過(guò)實(shí)際實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CloneSelect Imager在CloneMedia™ CHO Growth A半固體培養(yǎng)基中對(duì)懸浮CHO-s細(xì)胞的成像性能。這種半固體培養(yǎng)基成份經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)優(yōu)化，適合各種CHO細(xì)胞系的生長(zhǎng)。

CHO-s細(xì)胞培養(yǎng)和成像的操作流程如Figure 2所示。

 

使用CloneSelect Imager在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)微孔板進(jìn)行成像，以提供單克隆的數(shù)字圖片證據(jù)以及追蹤細(xì)胞生長(zhǎng)。每塊板分別在Day 0、1、2、7和8幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行成像。對(duì)于Day 0天的成像，微孔板要先在37°C培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。成像時(shí)，先針對(duì)A1孔使用autofocus功能，軟件自動(dòng)尋找最優(yōu)的對(duì)焦值，獲得整塊板最優(yōu)的成像效果（如Figure 3）。而且，這個(gè)對(duì)焦值會(huì)自動(dòng)被記錄，相同的對(duì)焦值會(huì)用于其他時(shí)間點(diǎn)的成像過(guò)程。

Figure 3：CloneSelect Imager系統(tǒng)設(shè)置對(duì)焦值（A）對(duì)焦設(shè)置軟件界面，Auto Focus按鈕用于自動(dòng)設(shè)置對(duì)6孔板CHO-s細(xì)胞成像的最優(yōu)對(duì)焦值。（B）使用Auto Focus功能，獲得的A1孔細(xì)胞成像圖片。

 

CHO-s細(xì)胞可以在CloneMedia CHO Growth A半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，形成緊致的球形克隆，非常容易識(shí)別。細(xì)胞種植密度為500 cells/ml，每孔形成的單個(gè)克隆數(shù)目在Day8天可以清晰辨認(rèn)（Figure 4A和4B）。使用半固體培養(yǎng)基有利于單個(gè)孔生長(zhǎng)出多個(gè)獨(dú)立的克隆，相對(duì)有限稀釋?zhuān)�需要的微孔板和培養(yǎng)基的數(shù)目大大節(jié)省。

Figure 4：CloneSelect Imager系統(tǒng)成像獲得的CloneMedia CHO Growth A半固體培養(yǎng)基中CHO-s細(xì)胞圖片：（A）種植密度為500 cells/ml的CHO-s細(xì)胞在Day 8天成像獲得的整孔圖片。（B）孔中部分克隆的放大圖片，可以清晰分辨出單個(gè)克隆。黃色圈（A）指示的是圖B放大顯示的部分。

 

使用CloneSelect Imager軟件可以放大單個(gè)克隆，通過(guò)鏈接不同時(shí)間點(diǎn)的克隆圖片可以追蹤克隆的生長(zhǎng)，驗(yàn)證克隆是否為單克隆。如Figure5 所示，顯示了兩個(gè)克隆的圖片。通過(guò) 比對(duì)兩個(gè)克隆不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)情況，追蹤到Day0天時(shí)圖片，可以確定克隆是否生長(zhǎng)于單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。半固體培養(yǎng)基額外加入的微珠（黃色圈標(biāo)識(shí)）可以作為成像位置的參照，以確定每次成像的都是相同的克隆。

Figure 5： CloneMedia CHO Growth A半固體培養(yǎng)基中CHO-s細(xì)胞圖片：CloneSelect Imager對(duì)6孔板在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)成像。在Day 0 天，如圖所示可以清晰觀察到上圖為一個(gè)細(xì)胞，下圖為兩個(gè)細(xì)胞。黃色圈標(biāo)出的是微珠的位置，用于作為位置參照以確定每次成像的都是同一個(gè)克隆

 

相比使用液體培養(yǎng)基進(jìn)行有限稀釋?zhuān)�使用CloneMedia CHO Growth A半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞是一個(gè)更加高效準(zhǔn)確的克隆方法。半固體培養(yǎng)基可以固定細(xì)胞的位置，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，不會(huì)影響細(xì)胞發(fā)生位置移動(dòng)。這種方法可以更加準(zhǔn)確地追蹤單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)為一個(gè)克隆。雖然CloneSelect Imager通常用于液體培養(yǎng)基中細(xì)胞的成像，但是也可以用于對(duì)半固體培養(yǎng)基中細(xì)胞的成像，提供了一個(gè)更加準(zhǔn)確的工具用于追蹤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及驗(yàn)證單克隆。