細(xì)胞凋亡檢測方法的簡介

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在生長到一定階段及某些生理過程中，會受到多因素和機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控而進(jìn)入死亡。這是一個(gè)動態(tài)的過程，會涉及一系列復(fù)雜的生化反應(yīng), 是一個(gè)需要酶參與的級聯(lián)反應(yīng),同時(shí)也涉及不同基因的表達(dá)及調(diào)控、信號傳導(dǎo)。其中有幾項(xiàng)生理過程能被用來檢測凋亡的發(fā)生，因此多參數(shù)分析法對于準(zhǔn)確檢測這一過程十分重要。同時(shí)，了解細(xì)胞死亡和存活機(jī)制也是毒理分析和藥物研發(fā)應(yīng)用中一個(gè)非常關(guān)鍵的內(nèi)容。

（一）Caspase活性檢測

Caspase（cysteinyl-aspartic acid proteases）是一個(gè)家族的蛋白酶，它的活化是細(xì)胞凋亡的典型特征。一旦一個(gè)Caspase 酶被激發(fā)，就會激活一系列其他的Caspas酶，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase 3 活化發(fā)生在凋亡早期，并在凋亡過程中起重要作用。Caspase-Glo®3/7 Assay提供了一種檢測Caspase-3/7活性的均質(zhì)的發(fā)光檢測方法。

（二）膜變化檢測

凋亡細(xì)胞另一個(gè)生化特征是細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸從胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞外。膜聯(lián)蛋白中的Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有強(qiáng)親和力，可通過使用Annexin V FLUOS Staining Kit或Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit方法進(jìn)行凋亡細(xì)胞早期檢測，使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測。同時(shí)使用PI，根據(jù)細(xì)胞膜的通透性區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

線粒體膜電位和膜通透性的變化也是凋亡細(xì)胞一個(gè)重要特點(diǎn)。可使用Mitochondria Isolation Kit分離凋亡細(xì)胞線粒體，其膜電位可通過線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)檢測，從而檢測早期的細(xì)胞凋亡。

（三）DNA片段化分析

DNA降解也是細(xì)胞凋亡的典型標(biāo)志之一,其降解產(chǎn)物可分為兩種，即高分子量的單鏈DNA缺口以及低分子量DNA片斷（單鏈及寡聚核小體）。

單鏈DNA缺口有特定的檢測方法，即利用酶催化，將特定核酸標(biāo)記到游離的3'-OH末端，這種方法被稱為TUNEL。Promega提供的DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System是由TUNEL 檢測法改良而來，能夠簡單、快速、準(zhǔn)確地在單細(xì)胞水平下原位檢測凋亡細(xì)胞。

在凋亡細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)的組蛋白聯(lián)合的DNA片斷（單鏈及寡聚小體），可使用Cell Death Detection ELISA PLUS高通量地檢測細(xì)胞死亡，或使用Apoptotic DNA-Ladder Detection Kit 通過純化及瓊脂糖電泳分析這些呈現(xiàn)出典型的ladder狀態(tài)的DNA片斷。

（四）細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測

細(xì)胞形態(tài)的變化如胞膜皺摺或出泡、核染色質(zhì)致密、胞質(zhì)濃縮等，都可作為細(xì)胞凋亡的證據(jù)。一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。