強迫游泳、懸尾、曠場實驗相關-抗郁丸對CUMS抑郁癥大鼠行為學及機理的影響

抗郁丸對CUMS抑郁癥大鼠行為學及機理的影響

摘要：目的 研究抗郁丸對慢性溫和不可預見性應激（CUMS）抑郁癥大鼠行為學及血清中甲狀腺激素、細胞因子的影響，探討抗郁丸治療抑郁癥的作用機理。

方法 采用慢性溫和不可預見性應激結合孤養(yǎng)方法構建CUMS大鼠模型。60只雄性大鼠隨機分為正常組（10只）和模型組（50只），模型組造模3周后，隨機分為模型對照組、丙咪嗪組及抗郁丸低、中、高劑量組，每組10只，記錄大鼠體重及糖水消耗量變化，并進行開場行為檢測、強迫游泳實驗及懸尾實驗。給藥8周后處死大鼠，腹主動脈取血，分離血清，測定大鼠血清中甲狀腺激素及細胞因子含量。

結果 模型對照組大鼠體重增長減慢，糖水消耗量減少，行為運動得分降低，強迫游泳不動時間及懸尾不動時間延長（P＜0．05），血清中四碘甲狀腺激素氨酸（T4）、促甲狀腺激素（TSH）含量降低（P＜0．05），白介素1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子（TNF－α）及IL－6含量升高（P＜0．05），與正常組相比差異有統計學意義�？褂敉杓氨�咪嗪可加快模型大鼠的體重增長，增加糖水消耗量，增加行為學得分，縮短強迫游泳不動時間及懸尾不動時間（P＜0．05），并提高血清中T4及TSH含量（P＜0．05），不同程度降低IL－1β、TNF－α及IL－6水平（P＜0．05），與模型對照組相比差異有統計學意義。

結論 抗郁丸能改善CUMS大鼠抑郁癥狀，逆轉抑郁癥大鼠血清中甲狀腺激素及細胞因子的含量，這可能是其發(fā)揮抗抑郁作用的重要機制之一。

關鍵詞：慢性溫和不可預見性應激；抑郁癥；甲狀腺激素；細胞因子

抑郁癥是一種由于身體某些器官功能紊亂或長期失落心境而引起的慢性應激病理狀態(tài)，其發(fā)病率高、發(fā)病年齡廣泛，嚴重威脅人們的健康和生命，導致沉重的社會負擔。資料顯示，全球抑郁癥發(fā)病率為4．2％，中國高達6．9％，并且以11．3％的增長率逐年增加。據預測到2020年抑郁癥將上升為全球第二大疾病負擔。因此，對抑郁癥發(fā)病機制及治療的探討成為世界關注的重點。目前臨床常用藥物包括三環(huán)類、四環(huán)類、神經遞質類抑制劑、單胺氧化酶抑制劑等，但由于副作用大、療效不理想、依從性差制約了臨床應用。而抑郁癥是一種典型的生物、心理、社會等多因素作用導致的疾病，可引起人體多系統的病理反應，因此多層次、多靶點的中醫(yī)治療具有一定的潛力和優(yōu)勢。根據傳統的疏肝解郁名方，我們開發(fā)出的抗郁丸以抗抑郁為主，兼有健脾理氣、養(yǎng)血柔肝、清熱除煩、養(yǎng)心安神之功效，本實驗通過慢性溫和不可預見性應激（chronicunpredictablemildstress，CUMS）結合孤養(yǎng)方式構建大鼠抑郁癥模型，研究抗郁丸對抑郁癥的功效，并以三碘甲狀腺氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲狀腺氨酸（tetraiodothyronine，T4）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulatinghormone，TSH）以及白介素-1β（interleukin1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactorα，TNF-α）為觀測指標，初步探討其作用機理。

1材料與方法

1．1 實驗動物造模及分組

選用SPF級健康雄性SD大鼠60只，體重（200±10）g，由中山大學動物實驗中心提供，許可證號為SCXK（粵）2011－0029。適應性飼養(yǎng)1周后，根據體重隨機分為正常組（n＝10）和模型組（n＝50），正常組5只／籠飼養(yǎng)，實驗中不受任何刺激，模型組單籠飼養(yǎng)，采用CUMS法，每天隨機進行一種應激：禁食（24h）、禁水（24h）、夾尾（1min）、晝夜顛倒、潮濕墊料（墊料：水＝1∶1）、鼠籠傾斜（45°）、冰水游泳（4℃，5min）、合籠（5只／籠，24h），前后兩天刺激不能相同，使大鼠不能預料刺激的發(fā)生種類，避免產生適應現象。造模3周后，將模型組大鼠根據體重隨機分為模型對照組（雙蒸水5ml／kg）、丙咪嗪組（15mg／kg）、抗郁丸低劑量組（144mg／kg）、中劑量組（288mg／kg）、高劑量組（576mg／kg），每組10只，各組每日灌胃一次，從第4周開始，連續(xù)給藥8周，給藥同時繼續(xù)進行刺激。

1．2 實驗試劑與儀器

抗郁丸，由無限極（中國）有限公司研發(fā)中心提供的復合藥，0．6g／片，主要成分為當歸、川芎、陳皮、香附、白芍。低、中、高劑量組大鼠的給藥劑量分別按照相當于成人使用量的0．5倍、1倍、2倍計算，配置成相應濃度的混懸液（144、288、576mg／kg），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩１�咪嗪（廣州市天騏生物科技有限公司），劑量15mg／kg，蔗糖（廣州輝旺實驗儀器有限公司），用大鼠日常飲用水配置成1％濃度溶液，現用現配。T3ELISA檢測試劑盒、T4ELISA檢測試劑盒、TSHELISA檢測試劑盒、IL-1βELISA檢測試劑盒、TNF-αELISA檢測試劑盒、IL-6ELISA檢測試劑盒（廣州市一科生物科技有限公司）。開場實驗敞箱（100cm×100cm×40cm）、強迫游泳玻璃缸（35cm×35cm×50cm）由上海欣軟信息科技有限公司定制；電子分析天平（MettleToledo，Swiss），低溫高速離心機（Eppendorf，Germany），Elx800酶聯免疫檢測儀（ELX800Bio-TecInstruments）。

1．3 各種行為學檢測

1．3．1體重測量與糖水消耗量測量

于同等條件下每周進行1次體重及糖水消耗量測定。適應性飼養(yǎng)的1周對大鼠進行1％糖水偏好訓練，每籠并排放置2個水瓶，兩瓶均為糖水放置24h，隨后一瓶糖水，一瓶純水放置24h，再經過24h禁食禁水后，進行第一次糖水消耗量基線測定，造模開始后的每周在固定時間測定一次，測定時均為單籠。以1h糖水消耗量為評價標準。

1．3．2開場行為實驗

于造模前、造模3周后、給藥8周后用開場實驗箱進行行為學觀察。開場實驗箱100cm×100cm×40cm，周壁為黑色，底面用白線劃分為面積相等的25個小方格。將單只大鼠置于光潔開場實驗箱中央，以動物穿越地面方塊數為水平運動得分（四爪均進入的方格才計數），以直立次數為垂直運動得分（兩前爪騰空或攀附周壁），以4min內大鼠行為學得分為評價指標。

1．3．3強迫游泳實驗

在大鼠造模前、造模3周后、給藥8周后在同等條件下進行，共3次。取一強迫游泳玻璃缸，加水深30cm左右，水溫穩(wěn)定在室溫，將大鼠輕放水中適應2min后連續(xù)觀察4min，以4min內大鼠累計漂浮不動時間為評價指標。

1．3．4懸尾實驗

在大鼠造模前、造模3周后、給藥8周后在同等條件下進行，共3次。將SD大鼠尾端2cm處固定于水平面上，使其呈倒掛狀態(tài)，頭部離臺面約30cm，四周以板隔離動物視線，適應2min后觀察4min內的累計不動時間（不動指標為大鼠除呼吸外所有肢體均不動）。

1．4血清中甲狀腺激素及細胞因子含量測定

大鼠于連續(xù)給藥8周后，采用腹主動脈取血5ml，4℃10000r／min離心10min，分離血清，置于－80°冰箱保存待測，采用ELISA方法檢測血清中T3、T4、TSH及IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。

1．5統計學分析

采用SPSS17．0軟件進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩分析采用LSD檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

3討論

20世紀60年代開始，人們針對抑郁癥發(fā)病機制的中樞神經遞質假說，試圖通過藥物誘發(fā)神經遞質功能紊亂來建立相應的動物模型，主要包括有5-羥色胺酸（5-HTP）誘導甩頭行為、利血平拮抗模型、高劑量阿撲嗎啡拮抗模型等，但藥物誘導的抑郁模型與人類抑郁癥的發(fā)病機制相差甚遠，且抑郁癥狀較單一。情志異常是抑郁癥的主要病因，情志病因的實質是不良生活事件形成的心理應激，因此用慢性心理應激的方法制作抑郁癥模型比較符合臨床實際，本實驗參考Willner等提出的慢性溫和不可預見性應激程序并加以改進，結合孤養(yǎng)方式構建大鼠CUMS抑郁癥模型，這與人類抑郁癥中慢性、低水平的應激源導致抑郁癥發(fā)生發(fā)展的機制更接近，糖水消耗是衡量動物對獎賞的敏感缺乏和快感消失的客觀有效指標，抑郁癥臨床表現雖復雜多樣，但其核心癥狀的實質是快感缺乏，糖水消耗量的減少，不僅較好地模擬人類抑郁癥的核心癥狀，而且操作簡便，重復性好，較敏感。研究結果顯示，造模3周后，模型組大鼠糖水消耗量減少，體重增長緩慢，各種行為出現異常改變，與正常組比較差異有統計學意義，因此認為CUMS抑郁癥模型造模成功，結果與文獻報道基本一致。經過抗郁丸連續(xù)8周的治療，抑郁癥大鼠的糖水消耗量增加，體重增長加快，抑郁行為得以一定改善，說明抗郁丸對CUMS誘導的抑郁癥大鼠具有一定的抗抑郁功效。甲狀腺功能和抑郁癥的關系一直受到人們的關注，但結論尚不明確。Whybrow等學者提出甲狀腺功能與抑郁癥有關，該學說指出甲狀腺功能低下者，血中T3、T4含量下降，可降低抑郁癥發(fā)生的閾值，更易發(fā)生抑郁。陳丹等在探討甲狀腺功能亢進與抑郁癥關系的臨床觀察中發(fā)現，在甲亢初期，T3、T4水平較高時患者表現為高代謝癥，抑郁癥的發(fā)病率極低，在甲亢的治療過程中，隨著病情的好轉，血清中T3、T4水平下降，抑郁癥的發(fā)病率由6．8％增加至51％，進一步治療后，甲狀腺水平正�；蚱�低，甚至出現甲狀腺減退時，抑郁癥的發(fā)病率超過50％，表明甲狀腺激素的動態(tài)下降參與抑郁癥的形成及病程變化。而趙博等實驗表明抑郁癥大鼠血清T4、TSH呈升高趨勢；陳寶忠等研究顯示抑郁大鼠T4含量降低，T3、TSH無明顯差異；佟海英等研究中，抑郁癥大鼠T3含量升高，TSH含量降低；本實驗中模型對照組大鼠血清中T4、TSH含量降低，抗郁丸可上調降低的T4、TSH水平。

甲狀腺激素水平與抑郁癥之間不一致的研究結論，折射出兩者之間復雜的相關性，而甲狀腺激素水平高低不一，除了與甲狀腺激素自身的分泌調節(jié)受多種因素影響相關外，還可能與實驗動物種屬和性別、造模刺激方式和強度、造模時間、采血時間等因素有一定的關聯性。“抑郁癥的細胞因子假說”為探討抑郁癥的機制和治療抑郁癥提供了一個新的視角，越來越多證據表明細胞因子和抑郁癥的發(fā)生之間存在密切聯系。多項臨床試驗發(fā)現，相對于非抑郁癥患者而言，抑郁癥患者外周血液中炎癥細胞因子呈高水平過表達狀態(tài)，經治療后抑郁癥狀緩解時細胞因子含量降低趨于正常水平。Wang等研究表明，注射細胞因子誘導劑的小鼠出現了體重下降、糖水消耗減少等抑郁樣行為，抗抑郁藥治療后其癥狀明顯好轉。Thierno等對心肌梗死后的抑郁大鼠進行治療后，大鼠的抑郁病態(tài)明顯改善，同時血液中炎性細胞因子水平下降。本實驗經檢測模型組抑郁大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6含量升高，抗郁丸治療后能有效降低IL-1β、TNF-α及IL-6的過表達，改善抑郁行為。細胞因子在抑郁癥的發(fā)生中可能的機制為：通過神經內分泌功能介導、通過神經遞質代謝介導、通過神經元細胞的功能介導。過度激活的細胞因子進入腦內相應區(qū)域，造成神經內分泌功能的紊亂、神經遞質代謝障礙等一系列異常改變，在抑郁癥的病理過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，抗郁丸能改善CUMS大鼠的抑郁癥狀，逆轉甲狀腺激素和細胞因子的異常水平，提示其可能是通過調節(jié)下丘腦－垂體－甲狀腺軸分泌功能、調節(jié)炎癥細胞因子表達從而發(fā)揮抗抑郁功效。