基于高分辨質譜的組學分析方法在白酒香型鑒別中的應用
程明川，李晨，呂辰，江崢
賽默飛世爾科技（中國）公司，上海，中國 201206
關鍵詞
Q Exactive；靜電場軌道阱高分辨質譜；組學分析；白酒；香型鑒別
1.引言
白酒在中國有著悠久的生產歷史, 是我國優(yōu)秀而寶貴的民族遺產，與白蘭地、威士忌、伏特加、朗姆酒、金酒并列為世界6大蒸餾酒。我國固態(tài)發(fā)酵白酒質量的影響因素很多, 每個生產批次所產酒的酒質是不一致的。為了統(tǒng)一達到本品所固有的各種微量成分和它們之間適宜的比例，就必須進行勾兌。經過勾兌后的成品白酒, 具有其固定的化學成分組成以及這些成分之間的固定量比關系,從而形成各自不同的香型和風味[1]。目前對白酒香氣成分的分析多采用 GC 或 GC/MS的方法[2]。而對于香型的鑒定，主要依靠品酒師的感官鑒別。該方法簡單快捷，但對人員要求較高，且較為主觀。也有采用電子舌技術對不同香型的白酒進行區(qū)分[3]，但電子舌技術尚有待進一步發(fā)展且通用性較差。本實驗采用超高效液相色譜（UHPLC）和基于Orbitrap高分辨質譜技術的Q Exactive臺式質譜儀，結合組學分析軟件SIEVE和統(tǒng)計學軟件SIMCA對不同香型的白酒進行了組學研究，利用多元統(tǒng)計分析建立了一種快速、準確、客觀地鑒別白酒香型的新方法，并對找到的標志物進行了鑒定。
2.樣品信息及分析流程
實驗分別收集了濃香型、醬香型和清香型三種香型的白酒樣品。每種香型內均包含不同品牌，不同品質等級等多個樣本。因白酒樣本復雜，在不同品牌或是同一品牌不同等級之間存在多樣性和差異性，為減少不確定因素，先將三個香型的樣本分成不同品牌和同一品牌不同等級兩個組，分別進行分析和比較。
不同品牌組：每種香型包含各個名優(yōu)品牌中最具有代表性的高端酒樣，每個樣本均是對應香型中的典型樣本。力求通過對該組的分析找出不同品牌之間按照香型區(qū)分的標志物。具體樣品信息見表 1。
不同等級組：每種香型包含同一典型品牌中從高端到低端的不同等級的樣本。對該組的分析可以找出不同等級的樣本之間共有的可以區(qū)分其他香型的標志性化合物，也可驗證在對不同品牌組分析中找到的典型標志性化合物是否存在于該品牌各個等級的樣品中。具體樣品信息見表 2。
為了最大程度地保留樣本內的化學成分，樣本僅使用0.22µm的濾膜過濾后，即采用正負切換掃描的方式對數據進行采集。數據用 SIEVE 軟件進行峰提取、過濾、對齊和差異化比較；使用 SIMCA 進行 PCA、OPLS-DA 等多元統(tǒng)計分析，并利用建立的數學模型對未知樣品進行判別預測，分析流程見圖 1。
3.實驗條件
3.1液相色譜條件
色譜儀：Thermo Scientific TM Ultimate 3000 RSLC
色譜柱：Thermo Scientific TM Accucore C8 (100×2.1, 2.6 µm)
流動相組成和梯度洗脫條件見表 3。
4. 結果與討論
4.1 實驗條件的選擇
為保證白酒樣品中盡可能多的成分能夠有效地被測定，本實驗對不同型號的色譜柱進行了考察，包括：AccucoreaQ、Accucore Hilic、Accucore C8、Syncronis C18 和Hypercarb。實驗結果表明 Accucore C8 色譜柱在正離子模式下能夠對白酒樣品中的化合物進行較好的分離和有較高的響應（圖 2）。
4.2 數據重現性
在組學相關試驗中，方法的重現性至關重要，需要保證數據在質量精度、保留時間及響應強度等方面具有很好的的重現性。本實驗在進樣序列中穿插了 QC 樣品，對系統(tǒng)的穩(wěn)定性進行了考察。在整個進樣周期（48 小時）內，保留時間（RT）偏差 ＜2 s，以某一化合物考察的響應值（NL）RSD 為 10% 左右，質量精度偏差在 1 ppm 以內。實驗結果表明，采用外標法進行一次校正后，系統(tǒng)有良好的穩(wěn)定性、重現性和質量精度。
4.3 統(tǒng)計學分析
采用 SIEVE 軟件對組分進行提取、過濾（P-Value ＜ 0.05）及統(tǒng)計學分析。不同品牌組和不同等級組分別得到 486 個和1246 個化合物。通過 SIMCA 軟件對上述化合物的 PCA 分析表明，在這兩個分析組中 3 種香型的白酒均能較好的分開，聚類趨勢明顯，無明顯離群組分且與其他組別有較明顯差異（圖 3）
采用 SIEVE 軟件找出所得化合物中ratio差別較大，且在XIC圖中有明確色譜峰的化合物，作為潛在標志物，如圖 4 所示（以化合物 S1 示例）。最終在兩個分析組中分別確定的標志物見表 5 和表 6。其中有 5 個化合物為兩個分析組的共有標志物。以這 5 個共有標志物為指標，采用 SIMCA 軟件進行正交校正偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），最大化地凸顯模型內部不同組別之間的差異。分析結果表明三種香型的白酒可以得到良好的區(qū)分（圖 5）。
4.4 建模與預判
以此 OPLS-DA 分析的模型對已知另一典型濃香型白酒樣品（沱牌曲酒，50°）進行預判分析，來考察選取的5個標志物對3種香型白酒的鑒別能力。結果表明，測試樣品可以很好的和濃香型樣品聚合在一起，和另外兩種組能很好的區(qū)分，判斷結果正確（圖 6）。
4.5 標志物鑒定
根據標志物的精確質量數、同位素分布和二級碎片離子等信息，采用 Xcalibur 軟件、MassFrontier 軟件和 ChemSpider 網絡數據庫進行了鑒定和確證，鑒定結果見表 7。
5. 結論
本實驗展示了基于組學的分析方法在食品種類鑒別中的工作流程。結果表明 Orbitrap 高分辨質譜技術結合組學分析軟件SIEVE 及統(tǒng)計學分析軟件 SIMCA，可以有效地鑒別濃香、醬香和清香三種香型的白酒。在實驗中鑒定到了 5 個共有標志物，其中包括濃香型白酒被廣為認知的特征成分己酸乙酯，與既有研究一致，也表明所選標志物具有極高的可信度。通過對已知樣本的預判測試，顯示出所建立模型可以很好的用于三種香型白酒的區(qū)分。標志物未在清香型白酒中發(fā)現，能與清香型白酒本身就分 3 種亞型有關。另外，通過樣本量的增加，所建立的模型進行樣品預測的準確度可能會進一步提高。后續(xù)還可采用該流程和方法對 12 種白酒香型中的其他香型和不同年份的白酒樣品進行分析和比較。利用本文建立的這一套工作流程，可以推廣到食品組學研究領域更廣范圍的品種鑒別、產地溯源、質量控制等各個研究方向。
參考文獻
[1] 周圍，等。名優(yōu)白酒質量指紋專家鑒別系統(tǒng)。分析化學，2006年4月，第32卷，735-740。
[2] 柳軍，等。應用GC-O分析比較兼香型和濃香型白酒中的香氣化合物。釀酒，2008年5月35卷，103-107。
[3] 王永維，等�；陔娮由嗟陌拙茩z測與區(qū)分研究。包裝與食品機械，2009年第27卷第5期，57-61。
