熒光偏振法快速準確高通量檢測IgG和含Fc段衍生物

熒光偏振法快速、準確、高通量檢測IgG和含Fc段衍生物

Dr. Carolanne Doherty
Valitacell, NIBRT, Fosters Avenue, Blackrock, Dublin, Ireland

1.     BMG多功能酶標儀可應用于定量IgG的新技術Valita™TITER

2.     采用熒光偏振法直接在細胞培養(yǎng)上清液中檢測IgG

3.     酶標儀預設檢測程序和數據分析模板提高研究速度

簡介

準確、快速和高通量檢測IgG對于大多數治療性抗體的開發(fā)和生產來說是必不可少的。單克隆抗體正在生物藥物領域大顯身手，大量的樣本正等待著進行篩選以進一步得到開發(fā)。這里我們介紹一種在細胞培養(yǎng)上清中直接定量IgG的全新的篩選技術：Valita™TITER。

現有的技術，包括蛋白A高效液相色譜（HPLC protein A）、ELISA技術、 蛋白A表面干涉法以及HTRF（均相時間分辨熒光）都具有明顯的缺點，包括價格昂貴、耗力以及耗時。

Valita™TITER方法是一種全新的非常精確、低成本的檢測IgG的方案，檢測范圍在2.5-80mg/L。Valita™TITER采用熒光偏振技術檢測IgG的Fc段與蛋白G的結合（圖1）。分析在96孔板中進行，操作簡單、高通量、快速且可自動化完成。分析可以在很少量的細胞培養(yǎng)基中進行且沒有繁瑣的準備過程。

在這個應用指引中，我們介紹了在PHERAstar®，POLARstar® Omega以及CLARIOstar®多功能酶標儀上使用Valita™TITER試劑盒定量檢測IgG的方案。

圖1：熒光偏振法定量測定IgG的Valita™TITER分析原理示意圖。96孔Valita™TITER微孔板的每個孔中預先包被了標記了熒光的可與IgG結合的多肽-蛋白G（A）。IgG樣本結合于多肽上并通過熒光偏振和彌散（去偏振）進行測定（B）。

圖2：分析原理：分析利用熒光偏振法進行IgG定量。通過測定因分子旋轉而產生熒光偏振來測定樣本的濃度。小的、無結合分子在溶液中轉動快，而大的、結合的分子轉動慢。

熒光偏振可以有效地分析分子大小的改變�！安粍印钡臒晒饣鶊F在偏振光的激發(fā)下會發(fā)出與激發(fā)光相同偏振方向的熒光。然而，轉動的熒光基團的熒光偏振方向與激發(fā)光偏振方向相比會有一定的改變。在溶液中小分子比大分子轉動更快，因此，連接有熒光基團的分子大小的改變，可以通過熒光去偏振程度的大小來進行測定。所以，當標記有熒光的蛋白G在沒有結合其它分子時，其轉動快，去偏振更多，而結合了IgG則相反（大5倍）（圖2）。這種偏振的改變應用于檢測溶液中的IgG。熒光偏振（FP）通過用平行偏振方向的激發(fā)光照射溶液并在平行方向和垂直方向上測定發(fā)射熒光。FP就是這兩個偏振熒光的歸一化后的差別，通常用mP表示。

Valita™TITER分析試劑盒
Valita™TITER APP軟件（試劑盒里提供）
IgG標準品（從人血清中獲得IgG）
PHERAstar, POLARstar Omega和CLARIOstar多功能酶標儀 (BMG LABTECH)

樣品的準備遵照試劑盒說明書的相應要求。標準曲線的繪制采用每個相對熒光值對應一個IgG標準品的方法。在Valta™TITER微孔板的每個孔中加入60µl重建緩沖液以及60µl標準品或樣品。混勻后避光孵育30分鐘。然后在POLARstar Omega、PHERAstar或CLARIOstar多功能酶標儀（BMG LABTECH公司）中，采用預置的檢測程序進行讀數（參數的設定詳見下表）。在MARS分析軟件中將獲得的Raw Data轉化成.csv格式文件，再用Valita™APP軟件進行分析。

結果與討論

圖3的標準曲線（2.5-80mg/L）是在BMG LABTECH公司具有熒光偏振檢測功能的多功能酶標儀（POLARstar Omega、CLARIOstar和PHERAstar）上用Valita™TITER試劑盒繪制的。所有酶標儀所獲得的結果都具備很高的穩(wěn)定性。

 

圖3：在CLARIOstar多功能酶標儀上用Valita™TITER構建的IgG定量標準曲線。誤差線表示3個復孔的標準差

最后，我們用不同條件培養(yǎng)的樣品，用Valita™TITER定量IgG的結果與用常規(guī)方法HPLC的結果進行對比。圖4顯示兩種方法測定結果的相關性，顯示兩種定量方法都有很好的準確性，而Valita™TITER分析速度更快因其不需要繁瑣的樣本準備過程。

 

圖4：Valita™TITER定量IgG的結果與常規(guī)HPLC的結果進行對比

結論

在研發(fā)和生產此類生物藥物中對混合樣本進行快速IgG濃度測定非常重要。這里我們介紹了一種基于熒光偏振法的快速、簡單的進行高通量IgG和Fc段衍生物測定全新技術——Valita™TITER分析法。Valita™TITER分析法可以直接對待測樣本中的IgG進行定量測定而無需繁瑣的樣本準備或純化過程。CLARIOstar， PHERAstar和POLARstar Omega應用于Valita™TITER分析時現實出卓越的性能。與其它IgG的定量方便相比，Valita™TITER具有高通量、簡單、準確、快速的特點。

視頻：
快易達-Titer：通過BMG帶熒光偏振酶標儀進行高通量細胞上清液中重組IgG定量的新技術

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