質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)

DNA片段之間的連接是通過DNA連接酶的催化實現(xiàn)的。DNA連接酶催化具有平末端或互補粘性末端的DNA片段間相鄰堿基通過3’,5’磷酸二酯鍵連接起來，該反為需能反應(yīng)，通常需要加入ATP或NADH，DNA連接酶對粘性末端的連接效率要遠(yuǎn)高于對平末端的連接效率。在基因基因工程實驗中，最常用的來源于T4噬菌體的T4DNA連接酶。對于平末端或互補的粘性末端可直接進(jìn)行連接反應(yīng)。一個片段是平末端，另一片段為粘性末端或兩個片段都是粘性末端但不配對，則需要通過各種方式使其可一匹配或通過平末端進(jìn)行連接。通常采用末端補平、加同聚物尾、加接頭等方式是目的片段之間能夠匹配。
 

進(jìn)行連接反應(yīng)時，為了減少片段的自連，通常要進(jìn)行去磷酸化，去磷酸化可通過堿性磷酸酶完成。比如將目的片段和載體進(jìn)行時通常要將載體去磷酸化，以減少載體的自連。同要進(jìn)行連接反應(yīng)也經(jīng)常對目的片段進(jìn)行磷酸化以增強目的片段的連接，在相鄰堿基間如果沒有磷酸在連接效率大幅下將，如果載體進(jìn)行了去磷酸化，目的片段可進(jìn)行磷酸化，以增強目的片段和載體的連接。
 

在連接反應(yīng)中，目的DNA片段和載體的比例是一個關(guān)鍵問題，對于長度為1kb的片段和3kb的載體而言，通常目的片段和載體的比例設(shè)為2：1或3：1，如果目的片段越長該比例應(yīng)再升高，因為主要考慮的是載體和目的片段之間的分子數(shù)的比例。反應(yīng)體系中核酸的濃度也是一個重要問題，通常反應(yīng)體系中反應(yīng)物濃度應(yīng)保持在25-100 ng / μl。
 

連接反應(yīng)和其它酶不同，需要在較低的溫度下進(jìn)行，通常在12～16℃過夜，也可在4℃過夜連接，如果是平末端連接，可適當(dāng)提高連接溫度。除上述因素外，DNA樣品的純度、鹽濃度等會影響連接效率。

1、目標(biāo)DNA片段（實驗九RT-PCR擴增產(chǎn)物）

2、載體（pGEMT-easy）

3、2 × ligation 緩沖液

4、T4 DNA連接酶

5、ddH2O

1、臺式離心機

2、恒溫水浴

3、微量移液器

1、取一個1.5ml離心管依次加入下列試劑:
 

2 × buffer：               5μl

pGEMT-easy：    0.5μl

目的片段：               2.5μl

T4連接酶：                1μl

ddH2O                       1μl

2、2000 rpm 離心30S，使反應(yīng)體系充分混合。

3、4℃過夜連接。