銀染法組織端粒酶活性TRAP電泳分析試劑盒產品使用說明書
銀染法組織端粒酶活性TRAP電泳分析試劑盒產品使用說明書
主要用途
YIJI銀染法組織端粒酶活性TRAP電泳分析試劑是一種旨在通過端粒酶體外合成端粒重復序列的引物延展方法，繼而進行多聚酶聯(lián)擴增反應，在非變性聚丙烯酰胺電泳上，通過經(jīng)典的銀染技術，呈現(xiàn)六堿基相間的階梯圖像，以分析和評價活細胞端粒酶活性的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于腫瘤、衰老等研究。產品即到即用，性能穩(wěn)定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，染色清晰，重復性好。
技術背景
端粒重復序列擴增方法（telomeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶聯(lián)擴增的敏感高效的體外端粒酶活性的檢測技術。首先，非端粒單核苷酸引物作為端粒酶的底物而持續(xù)延長產生六堿基差異的片段；然后，延長所獲得的產物在非端粒單核苷酸引物和逆向引物的參與下進行特異性擴增；內參引物的整合用于定量酶活性。銀染技術可以檢測25至50皮克DNA條帶。
產品內容
YIJI清理液（Reagent A） 30毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 3毫升
YIJI反應液（Reagent C） 1毫升
YIJI上樣液（Reagent D） 100微升
YIJI膠底液（Reagent E） 6毫升
YIJI凝結液（Reagent F） 1.5毫升
YIJI促進液（Reagent G） 200微升
YIJI膠體液（Reagent H） 60毫升
YIJI電泳液（Reagent I） 100毫升
YIJI固定液A（Reagent J） 40毫升
YIJI固定液B（Reagent K） 160毫升
YIJI染色液（Reagent L） 40毫升
YIJI中和液（Reagent M） 40毫升
YIJI顯影液A（Reagent N） 300微升
YIJI顯影液B（Reagent O） 300微升
YIJI終止液（Reagent P） 40毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存YIJI清理液（Reagent A）、YIJI裂解液（Reagent B）、YIJI反應液（Reagent C）和YIJI凝結液（Reagent F）在－20℃冰箱里，YIJI上樣液（Reagent D）和YIJI促進液（Reagent G）保存在4℃冰箱里；其余的保存在室溫下。YIJI上樣液（Reagent D）、YIJI膠底液（Reagent E）、YIJI促進液（Reagent G）、YIJI膠體液（Reagent H）和YIJI染色液（Reagent L），避免光照，有效保證6月
用戶自備
無離子水：用于染色使用的濃縮試劑
200毫升燒杯：用于配制工作液的容器
1.5毫升離心管：用于細胞裂解的容器
0.5毫升PCR管：用于擴增反應的容器
15毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器
50毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制和溶液混勻的容器
DOUNCE勻漿器：用于組織裂解
PCR儀：用于擴增反應物
微型臺式離心機：用于沉淀反應物
電泳儀：用于TRAP分子電泳分離
平式搖蕩儀：用于染色反應
染色塑料盒：用于PAGE凝膠染色的容器
自動成像儀或PHOSPHORIMAGE：用于電泳染色記錄
實驗步驟
- 樣品制備
- 手術取出動物組織，并秤取100毫克待測組織
- 放進預冷的50毫升錐形離心管
- 加入3毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A）
- 小心移去清理液
- 移入到一個液氮凍存管
- 即刻放進液氮罐過夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
- 放進DOUNCE 勻漿器
- 加入200微升預冷的YIJI裂解液（Reagent B）
- 勻化80下
- 小心轉移到1.5毫升離心管
- 放進冰槽里孵育30分鐘
- 即刻放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g （或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
- 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒）
- 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
- 擴增反應
- 準備2個0.5毫升PCR管，置于冰槽里
- 按照下表依次加入反應物
|
內容物 |
樣品管 |
陰性對照管 |
|
YIJI反應液（Reagent C） |
48微升 |
48微升 |
|
組織裂解懸液樣品 |
2微升（200納克組織總蛋白） |
―― |
|
YIJI裂解液（Reagent B） |
―― |
2微升 |
|
總量 |
50微升 |
50微升 |
- 混勻
- 室溫下（30℃）孵育30分鐘
- 即刻放進PCR儀，按照下表擴增
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反應溫度（℃） |
反應時間 |
反應循環(huán) |
|
94 |
90秒 |
1 |
|
94 |
30秒 |
28
|
|
60 |
30秒 |
- 分別加入5微升YIJI上樣液（Reagent D）
- 置入冰槽里等待上樣
- 垂直電泳分析
實驗開始前，將YIJI膠底液（Reagent E）、YIJI凝結液（Reagent F）、YIJI促進液（Reagent G）和YIJI膠體液（Reagent H）放進37℃恒溫水槽預熱。然后進行下列操作。
- 移出3毫升YIJI膠底液（Reagent E）到15毫升錐形離心管里
- 加入100微升YIJI凝結液（Reagent F）
- 加入10微升YIJI促進液（Reagent G）
- 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
- 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結
- 移出30毫升YIJI膠體液（Reagent H）到50毫升錐形離心管里
- 加入600微升YIJI凝結液（Reagent F）
- 加入60微升YIJI促進液（Reagent G）
- 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
- 插入10孔梳
- 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結
- 移取50毫升YIJI電泳液（Reagent I）到500毫升容器里，加入450毫升無離子水，混勻后，標記為YIJI電泳工作液
- 加入適量的YIJI電泳工作液到電泳槽里
- 在4℃環(huán)境下預運行15分鐘，電壓為150伏
- 上樣：25微升（注意：使用20堿基的DNA marker）
- 繼續(xù)4℃環(huán)境下電泳2小時，電壓為150伏，或直至溴酚藍（Bromophenol Blue）染料移動到膠體三分之二處
- 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊（注意：膠體脆弱）
- 分離玻璃板快，切除膠底
- 將膠體放進染色塑料盒里
- 染色處理
- 小心加入20毫升YIJI固定液A（Reagent J）到上述塑料盒里
- 小心加入80毫升YIJI固定液B（Reagent K），混勻
- 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育30分鐘，速度為50RPM
- 小心倒去固定液
- 小心加入80毫升用戶自備的無離子水
- 小心加入20毫升YIJI染色液（Reagent L）
- 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育30分鐘，速度為50RPM，避免光照
- 小心倒去YIJI染色液（Reagent L）
- 小心加入100毫升用戶自備的無離子水
- 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育1分鐘，速度為50RPM
- 小心倒去無離子水
- 準備1個200毫升燒杯
- 加入80毫升用戶自備的無離子水
- 加入20毫升YIJI中和液（Reagent M）
- 加入100微升YIJI顯影液A（Reagent N）
- 加入100微升YIJI顯影液B（Reagent O），混勻
- 小心倒入塑料盒里
- 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育6分鐘，速度為50RPM（注意：可見金黃色條帶；避免過度染色）
- 小心倒去顯影液
- 小心加入80毫升用戶自備的無離子水
- 小心加入20毫升YIJI終止液（Reagent P），混勻
- 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育30分鐘，速度為50RPM（注意：可以保存在終止液里）
- 小心取出膠體
- 即刻置于自動成像儀上或PHOSPHORIMAGE下成像記錄，并測算條帶強度
- 計算端粒酶活性：
- 染色處理
所有階梯條帶強度累加之和÷內參條帶強度＝相對TRAP活性
注意事項
- 本產品為10次操作（包括10次裂解、20次反應、2次電泳）
- 整個操作過程，須戴手套
- 必須使用帶濾芯的槍頭
- 所有器皿、離心管、液體等無RNA酶污染
- 建議使用裂解液作為陰性對照
- 內參分子大小為36bp
- 內參條帶信號過弱，表明端粒酶活性過高，建議稀釋或減少樣品量；建議實驗操作增加樣品濃度梯度
- 電泳前注意清洗樣品孔
- 電泳操作注意安全
- 染色時，須在室溫下操作，并避免光照；避免過度染色
- 染色時間可以根據(jù)情況調整（參考圖像如下：黑色箭頭指示內參條帶36堿基；括號區(qū)域表明六堿基相間的陽性條帶，起始條帶為50堿基）
- 本公司提供系列TRAP實驗技術產品
質量標準
- 本產品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產品經(jīng)鑒定無核酶污染
- 本產品經(jīng)鑒定顯帶清晰
