從樣本制備和轉(zhuǎn)印過程提高western blot的準確性

適當的樣本準備

樣品準備不當，會讓你頭疼不已，當準備裂解液時：

• 快速工作
• 保持低溫環(huán)境
• 增加蛋白酶
• 進行分裝，避免反復(fù)凍融

如果要分裝樣品，請確保等量分裝，以便檢查是否在此過程中丟失了目標。 如果您分離的樣品濃度非常低，請記住，使用高靈敏度底物和較少的裂解液。
如果你的裂解液中含有大量的DNA，它就會變得粘稠。 大量的DNA會使樣品難以移液，并且可能會在凝膠上產(chǎn)生條紋或污跡。 如果是這種情況，請確保在添加上樣緩沖液之前將DNA酶添加到裂解液中。
對于變性凝膠，不要忘記在電泳前將樣品在98°C加熱5分鐘。 這樣可以使樣品完全變性并確保得到干凈銳利的條帶。
 
一些技巧可供參考：
使用過濾后的緩沖液，在電泳前仔細檢查緩沖液，以確保緩沖液不會隨著時間的推移而沉淀。
當取下凝膠梳子時，請非常緩慢地進行，以免孔塌陷或扭曲。
使用上樣器進行上樣。 在上樣時，確保將尖端盡可能靠近孔的底部，緩慢的加入樣品，同時小心地將上樣器取出。
在每個孔中加載相同的體積，不要空位。
低電壓慢跑，特別是最初濃縮樣品時。
·    電泳完成后，使用干凈的刀片切除凝膠的孔和底部凝膠。 這些會導(dǎo)致輕微的高度差異，可能會干擾轉(zhuǎn)印。

轉(zhuǎn)印

轉(zhuǎn)印是將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜上的過程。

• 確保“三明治”的所有材料尺寸相同。 濾紙，膜和凝膠都應(yīng)該是完美的選擇。 這樣可以防止討厭的氣泡出現(xiàn)在你的膜上。
• 從膠板中取出凝膠時，不要拉伸凝膠。 用刀片從凝膠上取下底部和孔后，在凝膠上放置幾片預(yù)先濕潤的濾紙，輕輕地將其弄平。 濾紙將作為支撐，小心地剝離凝膠。

·    確保圓形工具驅(qū)趕氣泡。 動作要輕柔，以免扭曲凝膠。

有很多事情可以在這里出錯。
選擇適當?shù)臉藴驶�策略�?讓我們面對現(xiàn)實，無論你多么小心，都可能會得到一個有缺陷的凝膠或膜，這將毀了你的一天實驗。 但是，如果您使用總蛋白質(zhì)染色或加載對照抗體來標準化您的數(shù)據(jù)，您可以挽救您的實驗。例如使用AzureRed總蛋白染色劑，兼容下游western blot實驗，配合sapphire 雙模式多光譜成像系統(tǒng)，可進行多重?zé)晒鈾z測，定量更準確，使用更方便。
確保目標和內(nèi)參具有相同的線性范圍。 化學(xué)發(fā)光是半定量成像，避免飽和尤其重要。
選擇經(jīng)過充分驗證并在文獻中引用的高質(zhì)量一抗。
使用合適的底物以避免信號飽和。 Azure為您提供Radiance和Radiance plus化學(xué)發(fā)光底物，以滿足您的所有靈敏度需求。
考慮合適的背景去除方法，準確定量條帶。
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