Western Blot技術(shù)篇之樣品制備

Western Blot 是一種用于檢測蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的常用方法，可以對簡單或復雜生物樣品中的目標蛋白質(zhì)進行半定量或定量分析。其操作步驟包括：
 

• 從細胞、組織或體液中制備樣品（蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)濃度測量）

• 十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠通過電泳按大小分離蛋白質(zhì)

• 將分離的蛋白質(zhì)固定在硝酸纖維素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上

• 封閉膜上的非特異性蛋白

• 用特異性一抗探測靶蛋白

• 與標記的化學發(fā)光或熒光分子偶聯(lián)的二抗共孵育

• 檢測反映抗原/抗體結(jié)合的信號
• 使用軟件對目標蛋白條帶進行光密度分析

Western Blot是分子生物學和蛋白質(zhì)組學中最常用的技術(shù)之一。但Western Blot是一個多步驟的操作流程，因此任何一個步驟發(fā)生錯誤，都會導致最終的結(jié)果發(fā)生變異，從而降低了該技術(shù)的可靠性和可重復性。有研究表明，Western Blot的一些關(guān)鍵步驟，例如樣品制備方法、跑膠、轉(zhuǎn)膜、抗體的選擇以及定量所用的歸一化方法，對于可再現(xiàn)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果至關(guān)重要。
 

--樣品制備--

Western blot步驟中的一個經(jīng)常被忽視的方面是有效的樣品制備。有效的蛋白質(zhì)提取和純化步驟對蛋白質(zhì)印跡實驗的結(jié)果和解釋有重要影響。為了有效地提取蛋白質(zhì)，應(yīng)該選擇一種合適的均質(zhì)化方法，該方法可以通過細胞膜的破裂有效地釋放細胞內(nèi)的內(nèi)容物。另外，應(yīng)該選擇最佳的裂解緩沖液以促進蛋白質(zhì)的正確溶解并防止蛋白水解降解，從而獲得大量的目標蛋白質(zhì)。

從以下幾個方面介紹：
樣品制備的原則
蛋白樣品的類型
蛋白樣品制備的流程
組織或細胞破碎和裂解
破碎裂解的方法
裂解液一般組成

常見裂解液成份一覽表
蛋白酶抑制劑的類型
常見的蛋白酶抑制劑一覽表

參考文獻：

Protein Purification and analysis: next generation Western blotting techniques, Expert Rev Proteomics. 2017 Nov;14(11):1037-1053.

An Overview of Technical Considerations for Western Blotting Applications to Physiological Research, Scand J Med Sci Sports . 2017 Jan;27(1):4-25