Naica數(shù)字PCR在朊病毒感染的組織中IP10、KC和M-CSF表達增加的應用

近日中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所朊病毒實驗室，在Virologica Sinica雜志上發(fā)表“IP10, KC and M-CSF is Remarkably Increased in the Brains from the Various Strains of Experimental Mice Infected with Different Scrapie Agents”。該研究采用了Luminex、ELISA、IHC和RT-PCR等多種方法，發(fā)現(xiàn)IP10、KC和M-CSF轉錄及翻譯水平在不同羊瘙癢癥感染嚙齒類動物模型大腦中其含量顯著升高，且與小鼠的遺傳背景無關。這項研究旨在探究炎癥細胞因子和趨化因子與朊病毒疾病的相關性，這些數(shù)據(jù)使我們對朊病毒感染期間的炎癥反應和朊病毒疾病的進展有了更好的了解。該雜志2020年影響因子3.242。（詳情請見文末）

文獻內容

朊病毒疾病

癢病由亞病毒中的朊病毒所致，是一種長期的進行性、衰竭性與致死性的神經(jīng)疾病。朊病毒病(PrDs)是由聚集的感染性朊病毒蛋白(朊病毒)錯誤折疊引起。散發(fā)性克雅氏病(sCJD)則是人類最常見的朊病毒疾病，在人和動物的朊病毒病中觀察到類似的神經(jīng)病理學特征。腦內朊病毒的沉積與皮質海綿狀變性、神經(jīng)元丟失以及小膠質細胞和星形膠質細胞的活躍膠質增生有關，而小膠質細胞和星形膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細胞。膠質細胞作為先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其活化后產(chǎn)生的各種細胞因子可能參與了朊病毒病的進展。

在朊病毒疾病的大腦中反復出現(xiàn)炎癥細胞因子和趨化因子的異常升高，其中包括促炎性細胞因子IL1a、 IL1b 、TNF、IL6 以及抗炎細胞因子TGFb、IL4 和IL10 等。研究發(fā)現(xiàn)，在感染癢病菌株22L的小鼠中IP10和KC發(fā)生上調。IP10作為一種趨化因子，與受體CXCR3結合并激活多種信號通路，導致炎癥因子流入感染或炎癥組織。在朊病毒感染過程中，IP10介導的信號通路被激活，包括Erk1/2和JNK通路。與IP10一樣，KC也屬于趨化因子CXC家族，與炎癥、血管生成、腫瘤發(fā)生廣泛相關，并參與神經(jīng)退行性疾病的進展。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，M-CSF由星形膠質細胞合成，但鮮有研究報道M-CSF在朊病毒發(fā)病機制中的變化情況。

實驗室介紹

朊病毒病室實驗室隸屬于病毒病預防控制所，病毒病預防控制所是中國疾病預防控制中心下屬的獨立法人機構。其前身為1949年成立的中央衛(wèi)生研究院病毒系，后于1964年成立中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所，原隸屬于中國醫(yī)學科學院。1983年，病毒學研究所劃歸中國預防醫(yī)學科學院。2002年1月23日，病毒學研究所正式更名為中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，簡稱病毒病所。

朊病毒病室實驗室的主要研究方向：擬訂朊病毒病預防控制相關的規(guī)章規(guī)范、標準、技術指南及方案預案等提供科學依據(jù)；應對人類及動物朊病毒病疫情和突發(fā)公共衛(wèi)生事件提供技術支持，參與和指導地方相關疫情和突發(fā)公共衛(wèi)生事件的調查和處置；組織開展全國人類朊病毒病監(jiān)測工作，收集、分析、解釋、報告和反饋監(jiān)測數(shù)據(jù)，評價和改進監(jiān)測系統(tǒng)；協(xié)調與國家瘋牛病監(jiān)控網(wǎng)絡工作；開展監(jiān)測、檢測技術研究和技術貯備，為各級疾控機構的朊病毒病預防控制工作提供技術指導；開展朊病毒病原學、流行病學、遺傳學、神經(jīng)生物學、個體生物學等科學研究及朊病毒病致病機理的研究，開展相應的診斷、預防和治療等生物技術研究，開展其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的研究；建立和完善人類朊病毒病參比實驗室，開展朊病毒病相關毒種和生物樣本等資源的保藏和相關生物安全研究；開展朊病毒病相關的研究生教育培養(yǎng)和全國疾控人員的專業(yè)技術培訓，開展相關的國際合作與交流，參與朊病毒病的預防控制和研究工作；承擔上級交辦的其他各項工作。

摘 要

在朊病毒疾病患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，經(jīng)常觀察到炎癥細胞的激活和一些細胞因子的上調。為了評估朊病毒感染過程中一些很少被處理的腦細胞因子的潛在變化，該研究首先通過Luminex實驗篩選了感染不同癢病病株的小鼠腦中17種不同細胞因子的水平。在許多感染癢病小鼠的腦裂解液中檢測到IP10、KC和M-CSF顯著上調。ELISA和免疫組化實驗進一步證實了這三種細胞因子在癢病感染小鼠大腦中的表達上調。qRT-PCR和數(shù)字PCR檢測到感染癢病小鼠大腦中IP10、M-CSF和KC的特異性mRNA的增加。對感染后不同時間點采集的腦標本進行動態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)這三種細胞因子的增加呈時間依賴性，特別是在癢病感染潛伏期的IP10。此外，還發(fā)現(xiàn)45例散發(fā)性克雅氏病(sCJD)患者腦脊液(CSF)中IP10的水平略高于未診斷為朊病毒病的患者。

文中對感染小鼠大腦組織中的IP10轉錄本的絕對數(shù)量，使用的Naica數(shù)字PCR進行檢測，方法描述如下所示：

如下圖所示，使用實時熒光定量PCR和數(shù)字PCR對各種瘙癢病感染的小鼠模型中IP10，KC和M-CSF的轉錄水平進行比較分析。

A：相對于單個β-actin的轉錄水平，確定了IP10，KC和M-CSF特異性mRNA的轉錄水平。

B：感染139A，ME7的小鼠和對照組的大腦IP10 DNA拷貝數(shù)。

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https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12250-020-00216-3

Naica數(shù)字PCR平臺

法國Stilla Technologies Naica數(shù)字PCR平臺是實現(xiàn)DNA/RNA絕對定量的技術工具，自動生成單層平鋪的微滴，進行單分子PCR擴增，通過高分辨率的三色熒光通道檢測，自動QC質控，識別三色熒光中有效的陰陽性微滴，從而達到目的DNA/RNA的絕對定量檢測。同時提供原始數(shù)據(jù)、單微滴追溯等功能，確保數(shù)據(jù)真實可靠。

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期刊介紹

Virologica Sinica是中國科學院主管，中國科學院武漢病毒研究所和中國微生物學會共同主辦的學術期刊，創(chuàng)刊于1986年，2007年變更為英文全球出版。近年來，在主辦單位的大力支持下，在主編、編委會專家和審稿專家的學術引領和無私奉獻中，VS逐步成長為SCI期刊，并連續(xù)七年（2013-2019年）獲得“中國最具國際影響力學術期刊”稱號。在辦刊過程中，我刊始終堅持“提高論文質量，縮短出版周期，擴大國際影響”；聚焦病毒學學科熱點及前沿領域，組織刊發(fā)高水平論文及專刊；為廣大作者提供優(yōu)質高效的論文編輯服務，為高水平論文發(fā)表提供綠色通道。