無需ROX校準的Azure Cielo™ Real-Time PCR光學系統(tǒng)的應用
ROX是一種廣泛使用的惰性熒光染料，通常添加到qPCR反應液中以校正熒光信號。然而，隨著熒光技術在儀器中的發(fā)展，比如在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)，為了標準化而單獨使用染料的步驟已不再需要。當實時熒光定量PCR系統(tǒng)首次引入市場時，許多產品使用固定光源和檢測系統(tǒng)對96孔整板進行同時成像，導致熱塊中每個孔的光路不同（圖1）。光程差異將導致每個孔的絕對熒光測量值發(fā)生變化，這取決于它們在板上的位置。例如，具有較短光程的孔可能比具有較長光程的孔具有更高的熒光讀數(shù)，從而導致兩孔之間的熒光值偏差增大。因此，許多研究者開始使用參考染料（如ROX）對這種信號變化進行標準化校正。
Azure Cielo™實時熒光定量PCR的光學系統(tǒng)
由圖1可知，在傳統(tǒng)實時PCR系統(tǒng)的全板成像中，與角落的孔相比，中心區(qū)域的孔可以檢測到更高的熒光信號。由于ROX信號不受qPCR反應的影響，只要qPCR混合液的屬性保持不變，那么它在整個qPCR過程中也會保持穩(wěn)定�；谶@個原因以及ROX更優(yōu)越的光譜特性，ROX被視為一個很好的參考染料，可用于熒光信號的歸一化處理，以校準光程差引起的熒光變化。但是ROX作為參考染料的挑戰(zhàn)在于，它占用了一個可能用于檢測靶標的熒光通道。隨著流感病毒和COVID-19新冠病毒（參照ANDiS SARS-CoV-2 and Influenza A/B RT-qPCR Detection Kit）等應用變得越來越普遍，多重反應也越來越常規(guī)，這也說明了多通道檢測的重要性。
Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)采用新型的高性能光學系統(tǒng)，在qPCR實驗中無需ROX校準。該光學系統(tǒng)采用16組光纖單孔掃描設計，一根光纖用于高能LED激發(fā)，另一根用于光信號檢測，可16孔同時采集，確保數(shù)據采集的一致性（圖2）。此外采用“全孔檢測”技術，每個孔可采集大約100,000個數(shù)據點，檢測時取讀數(shù)的平均值，精準測定每個孔的熒光強度（圖3）。這種“全孔檢測”為每個采集時間點提供了比單孔掃描系統(tǒng)更具重現(xiàn)性和可靠性的數(shù)據，因為單孔掃描系統(tǒng)僅僅采集少量的數(shù)據點。
應用實例：
1、方法：
配制20µl反應體系，在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行10個重復孔的qPCR擴增。
2、結果與討論：
結果表明，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)能很好地檢測到每個qPCR擴增產物。由圖4可知，10個重復孔的擴增曲線高度一致，說明所有孔檢測到的信號均勻增加；計算得出Cq平均值為17.54，標準偏差低至0.02。Cq值的變異系數(shù)（CV）為0.13%，也反映了數(shù)據的高精準度。
光纖檢測系統(tǒng)與Marlow-Peltier溫度模塊相結合，在qPCR實驗中實現(xiàn)了孔間信號檢測的均勻性和加熱溫度的均勻性，并且由于每個樣品都是單孔激發(fā)和掃描，因此避免了背景信號的干擾。通過10個重復反應的低標準偏差和CV值進一步證明了Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)的產品特點，即可完全消除光程差，不需要使用ROX進行均一化處理，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)仍能獲得高精準度的可靠數(shù)據。
Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)
Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統(tǒng)來自于美國Azure Biosystems公司，可為您提供3/6檢測通道，根據實驗需求靈活配置。這款產品采用了高能LED作為光源系統(tǒng)，可保證光源強度高，光源一致性好；高品質的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統(tǒng)，升降溫速率快，可設置12列跨度30°C的溫度梯度；卓越的CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統(tǒng)，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準。Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)可為您的科學研究提供高精準度、高靈敏度和高可靠性的實驗結果。
