高通量流式技術應用紀要-Cell新冠免疫研究新進展

2020年11月Cell上發(fā)表了一篇新冠病毒研究文章，題為《Compromised Humoral Functional Evolution Tracks with SARS-CoV-2 Mortality》，來自麻省總醫(yī)院（MGH）、麻省理工學院（MIT）和哈佛大學的Ragon研究所等研究人員，揭示了SARS-CoV-2死亡率相關的體液免疫應答。
   
文章指出，對于新冠病毒的疫苗開發(fā)，目前仍然缺乏明確的免疫相關性研究支持。在其他病原體感染中，中和作用能產生保護作用，但不清楚在更為廣泛的人群中，只靠中和作用是否足以對抗SARS-CoV-2產生保護作用。因此，為了充分定義保護性體液免疫，研究人員分析了193名中重度住院患者體液反應的早期演變。
  
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在本項研究中，研究人員采用iQue高通量流式細胞平臺，結合基于微球的蛋白定量方法，對大批量的患者血漿樣本中的免疫球蛋白（IgG1、IgG3、IgM、IgA1和IgA2）進行快速高通量檢測和定量分析。
 
下面小編就帶大家看看這項研究是如何進行的。
  193名住院患者分為三組，在感染出現癥狀后1個月內采樣1-8次，共計392份血漿樣本（如圖A所示）：

• 中度感染后痊愈的住院病人，共82例，采集血漿樣本累計122份
• 重度感染后痊愈的住院病人，共76例，采集血漿樣本累計196份
• 重度感染死亡的住院病人，共35例，采集血漿樣本累計74份

 
對這193名SARS-CoV-2感染患者的392份血漿樣本進行5種免疫球蛋白定量分析。在該檢測中采用的是基于微球的蛋白定量法，結合iQue高通量流式細胞技術實現快速、高通量檢測和自動定量分析。具體來說，首先將感興趣的目的抗原（S蛋白）與熒光標記的微球進行共價結合，然后將偶聯抗原的微球進行清洗和阻斷，之后加入適當稀釋的病人血漿樣本，孵育一定時間后清洗，最后加入另一種熒光標記的檢測抗體，最后用iQue 高通量流式細胞儀采集血漿樣本，用Forecyte軟件分析數據獲得抗原特異性抗體的每個亞類和同型（IgG1、IgG3、IgA1、IgA2和IgM）的滴度數據。
  檢測結果發(fā)現（如圖B所示）：

• 癥狀出現1周內，三組患者均觀察到類似的SARS-CoV-2抗原特異性IgM和IgA滴度，嚴重疾病幸存者的特異性IgA1滴度略高。同樣，IgG3滴度也未觀察到明顯的組間差異。然而，抗S特異性IgG1滴度在中度和重癥患者間有顯著差異，而且重癥死亡病人的IgG1滴度更低。
• 到第2周時，與中度疾病患者和死亡患者相比，在重癥患者中觀察到幾乎所有S蛋白特異性抗體同型和亞類的滴度顯著升高，所有抗原的滴度也顯著升高。在死亡患者和中度疾病的患者中，S特異性IgG1滴度增高較慢。
• 到第3周，所有組的IgA和IgM水平幾乎相當。然而，與死亡組相比，患有中重度疾病的幸存?zhèn)�體在第三周都產生了更高的IgG亞類滴度，這表明在幸存者中IgG免疫力發(fā)展是一致的，而在非幸存者中則是延遲和受損的。

 
因此，盡管非幸存者在早期都產生了有力的IgG抗體和IgM抗體，但其IgG發(fā)展存在潛在的選擇性缺陷，與COVID-19死亡率相關。
 
事實上，研究人員不僅分析了針對S蛋白的特異性抗體免疫反應變化。作者在補充數據中還展示了這些患者血漿中針對RBD、N、S1 trimer、S1、S2蛋白的特異性抗體各種亞型（IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgM）在出現癥狀后1周、2周和3周以上的動態(tài)發(fā)展變化。
  小編初略一算，392份樣本，6種目的蛋白，5種抗體亞型，每個樣本要獲得30個讀數，共計11,760個數據點，這么高的通量，無怪乎研究人員選擇iQue——在最快的時間內，從少量的珍貴樣本中獲得盡可能多的信息，加快新冠研究進程！
 
隨后，考慮到IgG類別轉化的差異，研究人員還檢測了這種受損的類別轉化帶來的功能性結果，如SARS-CoV-2特異性抗體與低親和力IgG-Fcɣ受體（FcɣRs）和IgA-Fc -α受體（FcαR）結合的能力（結果如圖C所示），這對引起抗體效應功能至關重要，以及抗體介導的固有免疫效應功能，如抗體依賴的細胞吞噬（ADCP）、抗體依賴的中性粒細胞吞噬（ADNP）和抗體依賴的補體沉積（ADCD）效應（結果如圖D所示）。所有流式檢測均在iQue高通量流式細胞儀上完成。
 
為了進一步研究在SARS-CoV-2感染后重癥存活或未存活的個體之間，特異性抗體特性或抗原特異性是否存在差異，研究人員基于上述所有分析指標（抗體滴度、與不同IgG受體結合水平，及抗體介導的各種固有免疫效應）生成了極坐標圖（polar plot）來分析癥狀出現后1、2和3周體液免疫特征的潛在模式。
  如上圖所示，早在出現癥狀后的第一周，重癥存活患者中即觀察到體液免疫增強。雖然兩組患者的反應總體上都有所增強，但存活患者的反應比未存活患者的上升更為一致和強勁。雖然兩組的IgA、IgM反應類似，但總體而言，未存活患者組的IgG3水平、FcR結合和Fc功能呈現減弱趨勢。這在癥狀出現后第二周后可觀察到，在第三周這種趨勢進一步放大，與之前單變量分析中觀察的結果類似。尤其是，幸存者表現出整體較高的吞噬反應。為了闡明不同組間體液免疫應答的總體差異，每類特性單變量差異的非參數組合揭示，與死亡患者相比，重癥幸存患者的FcR結合水平早在癥狀出現后一周總體顯著增高，Fc功能性反應在第3周增高。這些數據突出了與COVID-19死亡率相關的體液免疫反應缺陷。
 
 
欲了解更多詳情，請點擊文獻原文《Compromised Humoral Functional Evolution Tracks with SARS-CoV-2 Mortality》，小編的分享就到這里啦！