鐵離子調(diào)節(jié)性細胞死亡的應用

“鐵死亡”這一概念最早在 2012 年由 Dr. Brent R Stockwell 提出，它是一種鐵離子依賴的新型細胞調(diào)節(jié)性死亡，在細胞形態(tài)學上，生化特征區(qū)別于細胞凋亡、壞死、自噬。從機制上簡單來說，鐵死亡是細胞膜上鐵依賴性的高表達的不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，誘導的細胞死亡。

 

 

近年來，鐵死亡相關研究是如火如荼，前途一片光明。今年 1 月，廣州醫(yī)科大學唐道林教授團隊在 Nat Rev Clin Oncol 上發(fā)表題為 Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer 的綜述。

 

圖 1. 鐵死亡在癌癥中的作用^[1]

 

在這篇高分綜述中，關于鐵死亡，作者提出了幾個觀點：

 

1、鐵死亡 (Ferroptosis) 是一種調(diào)節(jié)性的細胞死亡，依賴于鐵介導的氧化損傷。
2、鐵死亡可以通過兩條主要途徑：外源性 (轉運蛋白依賴) 途徑，內(nèi)源性 (酶調(diào)控) 途徑。
3、鐵積累的增加，自由基的產(chǎn)生，脂肪酸供應與脂質(zhì)過氧化物增加是誘導鐵死亡的關鍵。

 

 
 
 
鐵死亡的主要途徑
 

■ 外源性 (轉運蛋白依賴) 途徑

 

外源性途徑是通過抑制細胞膜轉運蛋白如胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白 (System xc^-)，或激活鐵轉運蛋白血清轉鐵蛋白和乳轉鐵蛋白啟動的。

 

1、抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白來促進鐵死亡

System xc^- 是細胞內(nèi)重要的抗氧化體系，該系統(tǒng)由 2 個亞基組成，SLC7A11 和 SLC3A2。SLC7A11 負責主要的轉運活性，對胱氨酸和谷氨酸有高度特異性，而  SLC3A2 則作為伴侶蛋白。System xc^- 以 1:1 的比例用胞內(nèi)谷氨酸來換取胞外的胱氨酸 (Cys₂)，胱氨酸在谷氨酸半胱氨酸連接酶 (GCL) 和谷胱甘肽合成酶 (GSS) 的催化作用下合成谷胱甘肽 (GSH)。

 

GSH 是膜脂修復酶——谷胱甘肽過氧化物酶 (GPX4) 的還原性輔因子。抑制 System xc^- 的活性會抑制胱氨酸的吸收，影響 GSH 的合成，繼而導致膜脂修復酶 GPX4 活性降低，細胞抗氧化能力降低，從而促進鐵死亡。

 

2、鐵轉運蛋白與鐵 “超載”

增加鐵的吸收，減少鐵的儲存和限制鐵的外流都會導致鐵積累增加，然后通過一系列的信號傳導途徑來促進鐵死亡。

 

轉鐵蛋白 (血清轉鐵蛋白或乳鐵蛋白) 通過轉鐵蛋白受體 (TFRC) 介導鐵攝取，F(xiàn)TH1/FTL (鐵蛋白組件) 通過自噬降解可以增加鐵的水平，這些都可以促進鐵死亡。而 SLC40A1 介導的鐵外流和外泌體介導的鐵蛋白輸出會抑制鐵死亡。

 

 

■ 內(nèi)源性 (酶調(diào)控) 途徑

 

內(nèi)源性途徑是通過阻斷細胞內(nèi)抗氧化酶 (如 GPX4) 激活的。

 

1、抑制 GPX4 誘導鐵死亡

脂質(zhì)過氧化物積累是鐵死亡的標志。GPX4 可將細胞毒性脂質(zhì)過氧化物 (L-OOH) 還原為相應的醇 (L-OH)，抑制 GPX4 活性會導致細胞膜脂質(zhì)過氧化物的積累。 

 

直接抑制：如 RSL3 作為鐵死亡誘導劑，可直接作用于 GPX4 并抑制其活性，因此降低了細胞的抗氧化能力并積累了 ROS，從而導致鐵死亡。

 

間接抑制：前面提到的抑制 GSH 的合成；硒代半胱氨酸是 GPX4 活性基團的必需氨基酸之一，抑制甲羥戊酸途徑可下調(diào)硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟來影響  GPX4 的合成，從而影響 GPX4 的活性并誘導鐵死亡。
 

2、其他酶的調(diào)節(jié)途徑與脂肪酸積累

乙酰輔酶 A 羧化酶 (ACAC) 介導的脂肪酸合成，脂質(zhì)吞噬 (Lipophagy) 介導的脂肪酸釋放，可誘導細胞內(nèi)游離脂肪酸的積累，促進鐵死亡。

 

長鏈脂肪酸輔酶 A 連接酶 4 (ACSL4) 和溶血磷脂�；�轉移酶 3 (LPCAT3) 促進多不飽和脂肪酸 (PUFA) 摻入磷脂中形成多不飽和脂肪酸的磷脂 (PUFA-PL)。PUFA-PLs 易受脂氧合酶 (ALOXs) 介導的自由基引發(fā)的氧化作用。這種氧化作用最終會導致脂質(zhì)雙層的破壞并影響膜功能，從而促進鐵死亡。

 
 
 
鐵死亡的研究策略
 

上文介紹了鐵死亡的基本途徑。鐵死亡有哪些研究策略呢？下面以文獻 Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis 為例。

 

作者團隊建立了特定病理過程 (鐵死亡) 的細胞模型，使用多種誘導劑和抑制劑，以及多種檢測方法證明鐵死亡與 AMPK 的調(diào)控關系，并建立了 AMPKα1/α2 的基因敲除細胞系 (AMPK DKO)，驗證 AMPK 缺失對鐵死亡敏感性的作用機制。

 

■ 確立鐵死亡病理模型

 

1、能量應激 (Energy stress) 抑制鐵死亡

首先，研究人員探索了永生化小鼠胚胎成纖維細胞 (MEFs) 中，葡萄糖饑餓條件對 Erastin 誘導的鐵死亡的影響。首先，證明 Erastin 誘導鐵死亡：Caspase-3 或 PARP 裂解均未下調(diào) (細胞凋亡的標志)，而且鐵死亡抑制劑 Ferrostatin-1 可以逆轉 Erastin 誘導的細胞死亡。最初他們預想，葡萄糖饑餓的條件會增強  Erastin 誘導的鐵死亡，結果恰恰相反：葡萄糖饑餓很大程度上逆轉了 MEFs 中引起的鐵死亡。

 

 

作者團隊進一步選擇了其他可誘導或模擬能量應激的化合物，包括 2-脫氧葡萄糖 (2-DG)、阿卡地新 (AICAR)、A769662。這些化合物也顯著抑制了由 Erastin 處理引起的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。綜上所述，能量應激抑制了鐵死亡。

 

2、AMPKα1/α2 的基因敲除細胞系建立

上述模擬或誘導能量應激的化合物均會激活 AMPK，那么 AMPK 是否參與能量應激介導的鐵死亡抑制？MEFs 中，如圖 4a-b，AMPK 雙敲除 (DKO) 可以完全逆轉誘導能量應激的化合物對 Erastin 誘導的鐵死亡的抑制作用。

 

緊接著，如圖 4c，作者又驗證了一組細胞系中的基礎 AMPK 激活狀態(tài) (p-AMPK Thr172 為激活標志) 與鐵死亡 (SLC7A11 的表達水平) 相關性。并且如圖 4c-d 所示，SLC7A11 高表達細胞相對于低表達細胞對鐵死亡的抵抗力更高，值得注意的是，雖然在 SLC7A11 高表達細胞中 AMPK 激活狀態(tài)與鐵死亡的敏感性無關，但 SLC7A11 低表達細胞中 AMPK 的激活與鐵死亡敏感性呈負相關。以上數(shù)據(jù)表明能量應激部分通過 AMPK 抑制了鐵死亡。
 

 

3、AMPK 失活使癌細胞對鐵死亡敏感

AMPK 在高基礎 AMPK 磷酸化水平的癌細胞系中是否會促進鐵死亡抗性？AMPK 抑制劑 Compound C 可下調(diào) AMPK 的激活，如圖 5a-b，Compound C 處理使 ACHN 細胞 (高基礎 AMPK 磷酸化的抗鐵堿化細胞系) 對 Erastin 或胱氨酸耗竭變敏感。透射電子顯微鏡 (TEM) 的結果也顯示，ACHN 細胞中，Compound C 與 Erastin 或胱氨酸耗竭共同處理導致線粒體收縮，膜密度增加，但細胞核中沒有明顯的 DNA 片段化 (鐵死亡的細胞特征形態(tài)特征)。這表明 AMPK 的抑制使癌細胞對鐵死亡敏感。

 

圖 5. Erastin 或胱氨酸耗竭條件下 ACHN 細胞對鐵死亡的敏感性

(a-b. CCK8 法和脂質(zhì)過氧化測定法檢測，Erastin 或胱氨酸耗竭條件下 ACHN 細胞對鐵死亡的敏感性；c. 透射電子顯微鏡 (TEM) 分析)

 

綜上所述，能量應激對鐵死亡的抑制作用，并且這種抑制作用部分是通過 AMPK 的激活實現(xiàn)的。
 

總結：

1、GSH-GPX4 抗氧化系統(tǒng)在鐵死亡途徑中起重要作用。脂質(zhì)過氧化物增加，轉鐵蛋白等介導的鐵的積累，以及細胞內(nèi)游離脂肪酸的積累都可以誘導鐵死亡。

 

2、Hyemin Lee 等人使用鐵死亡通路相關的抑制劑/誘導劑，以及建立了 AMPK 敲除細胞系，證明鐵死亡與 AMPK 之間的調(diào)節(jié)關系。

 

3、常見的檢測鐵死亡的實驗方法：鐵死亡相關細胞存活分析，如文中的 CCK8 法 (其他細胞活力檢測方法還包括 MTT 法，臺盼藍染色等)。

 

4、除了細胞活力測定，脂質(zhì)氧化水平的測定 (文中的 C11 BODIPY 581/591 染色)，GSH 測定，線粒體 ROS 測定，以及 GPX4 活性測定，電鏡下線粒體的變化的監(jiān)測，特異性靶標分子的分析 (WB、IHC、IF 等) 也是常用的檢測手段。

 

相關產(chǎn)品

Erastin 鐵死亡誘導劑，結合且抑制電壓依賴性陰離子通道 (VDAC2/VDAC3)。

RSL3 鐵死亡誘導劑，可直接降低 GPX4 的表達。

L-Cystine 一種氨基酸，在細胞調(diào)節(jié)過程中起著重要作用，胱氨酸耗竭會誘導鐵死亡。

Ferrostatin-1 選擇性的鐵死亡抑制劑，人工合成的抗氧化劑，通過還原機制來防止膜脂的損傷，從而抑制細胞死亡。

AICAR 腺苷類似物，也是一種 AMPK 激活劑，調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)的代謝。

A-769662 有效的，可逆的 AMPK 激活劑，EC50 值為 0.8 μM。

Compound C dihydrochloride 選擇性 AMPK 抑制劑，可參與細胞自噬以及鐵死亡。

CCK8 試劑盒  細胞活性和細胞毒性檢測的快速、高靈敏度試劑盒。

Thiazolyl Blue (‍‍MTT)‍‍ 可用于細胞增殖，活性毒性的檢測。

H2DCFDA 可滲透細胞的，用于檢測細胞內(nèi)活性氧 (ROS) 水平的探針。

JC-1 試劑盒 用于測量線粒體膜電位的熒光探針試劑盒。

TMRM Perchlorate 親脂性紅色熒光染料，可用于線粒體膜電位檢測。

鐵死亡化合物庫 收集了 500+ 種文獻報道的具有誘導或抑制鐵死亡相關的化合物及與鐵死亡密切相關的靶點對應的化合物，可以用于鐵死亡機制及相關疾病的研究。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務

 
縮寫

RCD: Regulated cell death

System xc^-: The cystine/glutamate transporter
ACAC:  Acetyl-CoA carboxylase
ACSL4：Acid-CoA ligase 4
GSH: Glutathione  
GCL: Glutamate-cysteine ligase  
GSS:  Glutathione synthetase  
Cys₂：Cystine
GPX4: Glutathione peroxidase  
TFRC: Iron-loaded serotransferrin-transferrin receptor  
FTH1/FTL: Ferritin component
WB：Western Blot
IHC: Immunohistochemistry
IF: Immunofluorescence
 
參考文獻

1. Daolin Tang, Xin Chen, Rui Kang, Guido Kroemer. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jan 29.
2. Hyemin Lee, et al. Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis. Nat Cell Biol. 2020 Feb; 22(2): 225-234.

3. Jie Li, Feng Cao , He-Liang Yin, et al. Ferroptosis: past, present and future. Cell Death Dis. 2020 Feb 3;11(2):88.
4. Caicun Zhou, Xuefei Li, et al. Targeting ferroptosis for cancer therapy: exploring novel strategies from its mechanisms and role in cancers. Transl Lung Cancer Res. 2020 Aug;9(4):1569-1584.