數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)小課堂之模板制備的操作

數(shù)字PCR是第三代PCR技術(shù)，和qPCR技術(shù)相比具有靈敏度高、精準(zhǔn)度高、對(duì)抑制劑耐受性更強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，并可直接對(duì)起始核酸進(jìn)行絕對(duì)定量，尤其適用于對(duì)低豐度樣品的檢測(cè)。目前，數(shù)字PCR在醫(yī)學(xué)、制藥、環(huán)境、食品檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。
 

 

集多重優(yōu)勢(shì)于一體的數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)該如何實(shí)施呢？今天呢，我們就一起來(lái)看一下數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)的第一步：模板的制備。
 

圖源：gene-π數(shù)字PCR學(xué)習(xí)網(wǎng)站
 

模板制備是數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵一步。模板提取、質(zhì)量控制、避免污染和保存都是模板制備過(guò)程中的重要因素。
 

1、清除環(huán)境污染

大多數(shù)Taq聚合酶的敏感性都比較高，一旦存在污染可能會(huì)發(fā)生外源DNA擴(kuò)增并影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)。而外界環(huán)境中存在多種污染源，因此必須遵守嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)規(guī)程并做好清除污染措施。

為了避免DNA污染，應(yīng)遵循以下常規(guī)PCR建議：

☑   定期使用3%漂白劑溶液和水/乙醇清潔實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)和設(shè)備，或根據(jù)應(yīng)用情況使用DNase/RNase；

☑   盡可能將管蓋好；

☑   渦旋后進(jìn)行離心；

☑   設(shè)置無(wú)模板對(duì)照。
 

2、模板提取

數(shù)字PCR的DNA和RNA模板提取方法與實(shí)驗(yàn)室中各種提取方法是兼容的，包括苯酚氯仿法,各種試劑盒提取方法。

☑   在提取過(guò)程中，盡量簡(jiǎn)化步驟，縮短提取時(shí)間；

☑   減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解；

☑   減少物理因素對(duì)核酸的降解，如機(jī)械剪切力和高溫；

☑   防止核酸的生物降解。
 

3、質(zhì)量控制

模板提取之后，我們需要對(duì)模板的純度和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，以保證得到最佳的實(shí)驗(yàn)效果。例如分光光度法可以驗(yàn)證提取的DNA溶液的良好吸光度(A260/280)的比例。常用的方法還有PicoGreen熒光染料定量檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管凝膠電泳和3'：5'分析等，盡量避免污染物和潛在抑制劑的存在。

4、保存

提取的DNA模板的存儲(chǔ)也是一個(gè)重要的監(jiān)控因素。保存時(shí)需要避免核酸降解，如胞嘧啶脫氨和8-Oxo-2'-脫氧鳥苷的形成，因?yàn)檠趸瘬p傷可能導(dǎo)致在PCR擴(kuò)增過(guò)程中的堿基轉(zhuǎn)位。緩沖液和溫度條件對(duì)樣品的質(zhì)量也有影響，一般提取的DNA模板用TE溶解并-20℃保存。
 

除了上述這些，樣本本身固有的其他參數(shù)也可能會(huì)對(duì)數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響：

A 、富含GC的模板

因?yàn)镚C鍵非常穩(wěn)定，如果模板包含富含GC的區(qū)域可能導(dǎo)致模板不能完全擴(kuò)增。因此，為了使模板獲得更好的變性，可以嘗試在PCR混合物中添加DMSO或甜菜堿。

B、高分子量DNA

與qPCR一樣，模板的復(fù)雜性可能會(huì)影響檢測(cè)性能，例如質(zhì)粒和長(zhǎng)片段基因組DNA。對(duì)DNA片段進(jìn)行限制性酶切可以平衡模板差異，并防止對(duì)目標(biāo)分子的低估。但要保證擴(kuò)增子序列中不能有酶切位點(diǎn)，對(duì)已經(jīng)片段化的DNA(例如來(lái)自福爾馬林固定、石蠟包埋組織或細(xì)胞游離的DNA)進(jìn)行酶切可能導(dǎo)致信號(hào)丟失。

通常高分子量的DNA或質(zhì)粒作為模板可能會(huì)影響陰陽(yáng)性微滴分區(qū)，建議在進(jìn)行數(shù)字PCR之前使用化學(xué)或酶切方法進(jìn)行DNA剪切，而且剪切步驟可以直接在PCR mix中進(jìn)行。

C、DNA拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)換

在數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中，需要對(duì)模板濃度進(jìn)行檢測(cè)，以避免濃度過(guò)高造成檢測(cè)結(jié)果飽和（全部都是陽(yáng)性微滴）。當(dāng)濃度足夠高時(shí)，常用的方法如熒光法和分光光度法，可用于定量核酸，從而初步預(yù)估使用數(shù)字PCR的適合測(cè)量濃度。值得注意的是，這種方法測(cè)量的是組成核酸堿基單位體積的質(zhì)量。因此，使用測(cè)量質(zhì)量的方法來(lái)確定基因組拷貝數(shù)，需要進(jìn)行相應(yīng)的換算。當(dāng)以質(zhì)量為基礎(chǔ)的核酸定量與dPCR結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，或從任何用于計(jì)算分子拷貝數(shù)的方法中得出的結(jié)果時(shí)，必須包括用于計(jì)算基因組分子量的清晰描述，以及用于計(jì)算該值的方法。

在數(shù)字PCR中，DNA拷貝數(shù)的計(jì)算只需要知道被研究基因組的質(zhì)量，然后應(yīng)用以下公式即可：反應(yīng)體積中拷貝數(shù)=反應(yīng)體積DNA質(zhì)量(ng)/研究基因組質(zhì)量(ng) 。

這里還有在線網(wǎng)站供大家參考：http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html

詳情可參考深藍(lán)云公眾號(hào)的推文：技術(shù)小站 | 濃度到拷貝數(shù)的換算。

D、逆轉(zhuǎn)錄酶

在逆轉(zhuǎn)錄酶數(shù)字PCR (RT-dPCR)中，RNA轉(zhuǎn)錄本需通過(guò)一步法或者兩步法轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA (cDNA)進(jìn)行使用。在一步法中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR均在同一分區(qū)中按順序排列。即使每個(gè)RNA分子產(chǎn)生多個(gè)cDNA拷貝，結(jié)果也不會(huì)被高估。在兩步法中，先進(jìn)行批量轉(zhuǎn)錄，然后對(duì)cDNA進(jìn)行微滴分區(qū)，在單獨(dú)的反應(yīng)中進(jìn)行dPCR。逆轉(zhuǎn)錄酶的步驟可能是一個(gè)主要的錯(cuò)誤來(lái)源，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中考慮。

通過(guò)上述的介紹，大家是不是發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR的模板制備并沒(méi)有那么復(fù)雜呀，感興趣的小伙伴可以先把模板制備好，然后聯(lián)系我們，趕緊來(lái)體驗(yàn)一下數(shù)字PCR的魅力吧。

 

 

參考文獻(xiàn)：

1 Cai, Y., Li, X., Lv, R., Yang, J., Li, J., He, Y., & Pan, L. Quantitative Analysis of Pork and Chicken Products by Droplet Digital PCR. BioMed Research International, 2014, 810209. http://doi.org/10.1155/2014/810209. PMID: 25243184

2 Pérez-Barrios, C., Nieto-Alcolado, I., Torrente, M., Jiménez-Sánchez, C., Calvo, V., Gutierrez-Sanz, L., Palka, M., Donoso-Navarro, E., Provencio, M., Romero, A. Comparison of methods for circulating cell-free DNA isolation using blood from cancer patients: impact on biomarker testing.  Transl Lung Cancer Res. 2016 Dec; 5(6):665-672. doi: 10.21037/tlcr.2016.12.03. PMID: 28149760

3 Demeke, T., Malabanan, J., Holigroski, M., Eng, M. Effect of Source of DNA on the Quantitative Analysis of Genetically Engineered Traits Using Digital PCR and Real-Time PCR. J AOAC Int. 2017 Mar 1;100(2):492-498. doi: 10.5740/jaoacint.16-0284. Epub 2016 Dec 22. PMID: 28118137

4 Holmberg, R.C., Gindlesperger, A., Stokes, T., Lopez, D., Hyman, L., Freed, M., Belgrader, P., Harvey, J., Li, Z. Akonni TruTip® and Qiagen® Methods for Extraction of Fetal Circulating DNA-Evaluation by Real-Time and Digital PCR. PLoS One. 2013 Aug 6;8(8):e73068. doi: 10.1371/journal.pone.0073068. Print 2013. PMID: 23936545.

5 Rajasekaran, N., Oh, M. R., Kim, S.-S., Kim, S. E., Kim, Y. D., Choi, H.-J., Byum, B., Shin, Y. K. Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines. Journal of Visualized Experiments : JoVE, 2015, (104), 53190. Advance online publication. http://doi.org/10.3791/53190. PMID: 26484710.

6 Devonshire, A. S., Whale, A. S., Gutteridge, A., Jones, G., Cowen, S., Foy, C. A., & Huggett, J. F. Towards standardisation of cell-free DNA measurement in plasma: controls for extraction efficiency, fragment size bias and quantification. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2014, 406(26), 6499–6512. http://doi.org/10.1007/s00216-014-7835-3. PMID: 24853859.

7 Group T D , Huggett J F . The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020[J]. Clinical Chemistry(8):8.