naica️®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在RNA質量評估的應用

國家CDC在Diagnostic Microbiology and Infectious Disease發(fā)表了一篇文章，文中使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測了不同時間段臨床流感樣本的病毒載量，來評估RNA完整性和樣本采集質量及對監(jiān)測系統(tǒng)中流感診斷的影響。.

應用亮點：

▶ 使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)完成RNase P(RNP)RNA和流感基因的檢測。

▶  低病毒載量的流感樣品（<10 拷貝/μl），在采集八天后依舊可以被naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測到，高低病毒載量的流感樣品之間存在明顯不一致的降解速率。

▶ 檢測作為樣本采集質量的關鍵指標RNase P(RNP)RNA，對于流感的預防和控制至關重要。

流感監(jiān)測對于流感的預防和控制至關重要。然而醫(yī)院一般只進行流感抗原快速檢測，核酸鑒定卻在網(wǎng)絡實驗室進行。由于流感病毒作為一種RNA病毒，不如DNA病毒穩(wěn)定。因此診斷目標區(qū)域的RNA穩(wěn)定性和完整性是實驗室檢測的主要挑戰(zhàn)，并且人們對冷藏臨床標本中流感核酸的穩(wěn)定性也知之甚少。本文采用先進的核酸定量技術--naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)、用于對臨床樣本的RNA完整性進行系統(tǒng)評價，探索流感監(jiān)測標本質量控制和評價的科學方法。

通過實時RT-PCR檢測的所有甲型或H1型流感陽性樣本用數(shù)字RT-dPCR檢測也呈陽性。圖1清楚地顯示了RNA隨時間的降解。在甲型流感和H1流感測試中，RNA降解隨著時間的推移不斷擴大。在所有四個時間點通過數(shù)字RT-dPCR共檢測了91個甲型流感病毒陽性樣本的RNA含量和72個H1陽性樣品的RNA含量，發(fā)現(xiàn)低病毒載量樣本RNA降解比高病毒載量更顯著且速度更快。在低病毒載量甲型流感樣本測試中，第4組RNA降解率為75%至100%共有8個，其中有5個樣本的RNA降解為檢測不到（圖1C）。在H1測試中，在第4組中75%至100%的RNA降解有9個低病毒載量樣本，其中7個樣本的RNA降解為檢測不到（圖1D）。

▲圖1.陽性樣本的RNA隨時間降解。(A)甲型流感陽性樣本的RNA降解。(B) H1陽性樣本的RNA降解。(C)低病毒載量甲型流感樣本的RNA降解。(D)低病毒載量H1樣本的RNA降解。(E)高病毒載量甲型流感樣本的RNA降解。(F)高病毒載量 H1 樣本的RNA降解。RNA降解=（第1組RNA含量-第n組RNA含量）/第1組RNA含量*100%。Y軸代表樣本數(shù)。藍色條表示0-25%之間的 RNA 降解，橙色條表示 25%-50%之間的RNA降解，灰色條表示50%-75%之間的RNA降解，黃色條表示 75%-100%之間的RNA降解。

在研究中使用第1組RNP和流感RNA濃度參數(shù)比較樣本采集質量。RNP值是樣本采集質量的關鍵指標。樣品質量采用 A-D 等級進行評估。圖2表明，樣本采集質量存在明顯變化。圖3比較了四家醫(yī)院的樣本質量。在甲型流感檢測中，從M醫(yī)院采集的樣本質量最好，N、L、P醫(yī)院采集的樣本質量次之；在H1測試中，醫(yī)院N采集的樣本質量最好（圖3）。

▲圖2：樣本采集質量評估。(A)使用甲型流感和RNP參數(shù)評估樣本采集質量。(B)使用H1和RNP參數(shù)評估樣本采集質量。X軸代表流感A M基因(A)或H1 HA基因(B)的Log10 RNA濃度。Y軸代表RNP的Log10 RNA濃度。一個點代表一個樣品的結果。紅點代表M醫(yī)院樣本，黃點代表L醫(yī)院樣本，綠點代表N醫(yī)院樣本，藍點代表P醫(yī)院樣本。樣本質量分為A、B、C、D四個等級。

▲圖3：不同醫(yī)院樣本采集質量的比較。(A)不同醫(yī)院甲型流感陽性樣本采集質量的比較。(B)不同醫(yī)院H1陽性樣本采集質量比較。藍條代表A級樣本，綠條代表B級樣本，紅色條代表C級樣本，黃色條代表D級樣本。

使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測流感樣本的病毒載量，研究RNA完整性和樣本采集質量，提醒我們，應定期開展樣本質量評估，以發(fā)現(xiàn)和改進醫(yī)院樣本采集中存在的問題。