RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)詳解
前言
RT-PCR就是逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription PCR）或稱為反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription-PCR，RT-PCR），是以RNA為材料應(yīng)用于PCR擴(kuò)增中的一種實(shí)驗(yàn)方法。首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA或信使RNA（mRNA）轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。其次Taq DNA聚合酶以cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。RT-PCR已被廣泛應(yīng)用于多種分子生物學(xué)應(yīng)用中，包括基因表達(dá)分析、基因測(cè)試、RNA干擾驗(yàn)證檢測(cè)、微陣列驗(yàn)證、病原體檢測(cè)和疾病研究。
RT-PCR的方法之一步法和兩步法
RT-PCR其操作方法分為兩種，即一步法和兩步法。一步法RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄同PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起，即cDNA合成與PCR擴(kuò)增反應(yīng)在同一管Buffer及酶中進(jìn)行，一步完成。兩步法RT-PCR，RNA首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分成兩步進(jìn)行。
兩種方法如何選擇及優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比
RT-PCR中模板的選擇
在RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中，選擇總RNA或純化的mRNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄十分重要。mRNA雖然能提供略高的靈敏度，但總RNA經(jīng)常使用，具有較mRNA更重要的優(yōu)勢(shì)。第一，其過程需要較少的純化流程，這保證了更好的回收模板和更好的把結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為起始的細(xì)胞數(shù)。第二，避免mRNA富集步驟，為了避免不同mRNA的回收率而帶來結(jié)果偏移的可能性�？傊�，在大多數(shù)的應(yīng)用中，目標(biāo)基因的相對(duì)定量比檢測(cè)的絕對(duì)靈敏度更重要，因此在多數(shù)情況下，總RNA更適用。
反轉(zhuǎn)錄酶的選擇
反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase）又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。是以RNA為模板指導(dǎo)dNTP合成互補(bǔ)DNA（cDNA）的酶。一部分反轉(zhuǎn)錄酶具有RNA酶活性，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉(zhuǎn)錄酶沒有Rnase酶活性，可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶。依據(jù)RT-PCR，理想的狀態(tài)下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的反轉(zhuǎn)錄酶，cDNA的合成才能在較高的溫度下進(jìn)行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，并確保在整個(gè)反應(yīng)過程中的全部活性，從而得到質(zhì)量更高的cDNA。
RT-PCR引物的選擇
逆轉(zhuǎn)錄引物一般包含3種：oligo dT引物，隨機(jī)引物和特異性引物。對(duì)于短的且不具備發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可用。
RT-PCR引物設(shè)計(jì)原則
1. 上下游引物要保守：擴(kuò)增子長(zhǎng)度需選擇一段保守片段（100-200 bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇片段需跨越內(nèi)含子，因內(nèi)含子的基因組DNA序列不會(huì)被擴(kuò)增，也可減少?gòu)奈廴镜幕蚪MDNA中擴(kuò)增得到的假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。引物選取同樣需要保守。
2. 引物長(zhǎng)度和Tm值：引物設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為18-25 bp，Tm值在50-65℃之間，引物中GC含量在40-60%。設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量避免出現(xiàn)4個(gè)或超過4個(gè)G堿基。
RT-PCR實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照
反轉(zhuǎn)錄陰性對(duì)照應(yīng)包括在所有的RT-PCR的實(shí)驗(yàn)中，用來檢測(cè)DNA是否污染（如基因組DNA或PCR產(chǎn)物）。該對(duì)照所指不加反轉(zhuǎn)錄酶，通過反轉(zhuǎn)錄過程得到cDNA在進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。如檢測(cè)到擴(kuò)增，則樣本中可能含有基因組DNA污染。
