中藥材黃曲霉素檢測技術操作詳解
一、 中藥材質量安全現狀
中藥材是中醫(yī)防病治病的重要基礎。中藥材在田間生長、采收加工、儲藏運輸等各個環(huán)節(jié)都會因污染霉菌而發(fā)生霉變。這些霉菌分泌的有毒代謝產物使中藥材發(fā)霉變質，直接威脅到群眾的用藥安全。中藥中的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素，赭曲霉素，玉米赤霉烯酮，展青毒素，伏馬毒素等。中藥材的種類是影響真菌毒素污染的主要因素,易污染的中藥材,在不同的溫、濕度條件下均可產生真菌毒素。溫度和濕度條件也可以影響真菌毒素的增長,如：黃曲霉毒素在不同的溫、濕度條件下均可以產生；赭曲霉毒素需要在濕度較高的條件下才能產生。
近年來,隨著中藥材在國際市場上的持續(xù)升溫,其安全性越來越引起人們的關注。真菌毒素殘留作為中藥材微量外源性有毒有害物質,一般不表現出急性毒性,但通常有較強的蓄積性,致癌、致畸、致突變作用明顯,嚴重影響中藥材的安全性。
二、 中藥材真菌毒素控制相關國家法規(guī)
近年來，各級食品藥品監(jiān)管部門不斷加大中藥監(jiān)管力度，努力保持中藥質量總體穩(wěn)定。
國家食品藥品監(jiān)督管理局關于規(guī)范中藥生產經營秩序嚴厲查處違法違規(guī)行為的通知（國食藥監(jiān)安[2012]187號文件）中，要求加強對黃曲霉毒素、重金屬及有害元素、農藥殘留量等安全性指標的檢測和控制，切實保證中藥材質量和安全，另要求企業(yè)具備與生產品種相適應的檢驗設備和能力，嚴把質量檢驗關。
《國家藥品安全“十二五”規(guī)劃》，規(guī)劃中明確指出“開展藥品快速檢驗技術研究，搭建檢驗技術共享平臺”、“加快推進藥品快速檢驗技術在基層的應用，配置快速檢驗設備”，“加強縣級機構快速檢驗能力建設”的要求。
三、 中藥材真菌毒素檢測項目及限量標準
國家食品藥品監(jiān)督管理局對柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎等14味藥材及其飲片品種項下增加“黃曲霉毒素”檢查項目，限度為“黃曲霉毒素B1不得過5 μg/kg；黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2總量不得過10 μg/kg”。
2010 版《藥典》附錄IX V 黃曲霉毒素測定采用高效液相色譜法，另外增補藥典描述該法檢測建立增加柱后光化學衍生法。
四、 中藥材黃曲霉素檢測方案介紹
（一） 儀器分析法
特點
免疫親和柱-高效液相色譜法：符合2010版《藥典》附錄IX V中黃曲霉毒素測定高效液相色譜法，另外增補藥典描述該法檢測建立增加柱后光化學衍生法。
1. 設備和耗材配置
2. 樣品前處理:冠一為中藥材提供不同的處理方案(詳細方案請聯系冠一，冠一開發(fā)了針對多種中藥材基質提供優(yōu)化的處理方案)
3. 免疫親和柱凈化:
富集--洗滌--洗脫--收集全部洗脫液供化學衍生檢測用。
4. 化學衍生
為什么使用光化學衍生器？ 由于黃曲霉具有較強的紫外吸收和產生熒光的特性，因此可以進行HPLC-紫外或熒光檢測，但是同時黃曲霉毒素中的B1、G1 由于其在含水的流動相中容易產生熒光淬滅，因此在很多的實驗中都會采用衍生法測定黃曲霉毒素。衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在線的，由于在線的柱后光化學衍生有明顯的優(yōu)勢，所以現在被增補為藥典的檢測方法，優(yōu)勢主要在于無需任何化學試劑、對人員無傷害；無需人員直接操作、避免誤差; 無需擔心衍生液腐蝕檢測器。
5. 高效液相色譜分析
（二）酶聯免疫法
特點
冠一推出的GuanyiBiotR黃曲霉毒素總量試劑盒具有較高的靈敏度和準確度，適用于大量樣本的定量分析。
1. 方法原理
采用直接競爭酶聯免疫法，在微孔板上預包被黃曲霉毒素抗原，加入樣本（或黃曲霉毒素標準品溶液）及辣根過氧化物酶標記的黃曲霉毒素特異抗體。樣本或標準品溶液中的抗原與預包被在板孔上的抗原競爭結合酶標抗體。未結合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣品吸光值與其所含黃曲霉毒素總量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣品中黃曲霉毒素總量的含量。
2. 設備和試劑配置：
3. 樣本前處理：中藥材：粉碎、提取、離心，取上清液加入GuanyiBio離心小柱進行凈化。
為什么要用GuanyiBio離心小柱？中藥材的基質復雜，提取時樣本液顏色較深，而且不容易去除。有機試劑提取凈化方法繁瑣，試劑揮發(fā)對環(huán)境及人體造成危害，且凈化效果不穩(wěn)定。用GuanyiBio離心小柱，則只需提取液離心過柱，即可去除提取液中的雜質，方便快捷，凈化效果好，且回收率可以達到85%以上。
4. 檢測步驟
4.1 免疫反應30min；洗板5次；顯色反應30min；終止反應，酶標儀讀OD值。
5. 分析結果的表述
用酶標儀判讀結果。
（三）免疫金標快速檢測法
特點
冠一推出的GuanyiBioTM黃曲霉毒素總量免疫金標快速檢測條特異性好，適用于檢測樣本量大；短時間出具檢測結果并控制經費的情況，可以快速定性，初篩。
1. 方法原理
黃曲霉毒素總量快速檢測條應用了競爭抑制免疫層析的原理，樣本中的黃曲霉毒素總量在酶標孔中與膠體金標記的特異性抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合，抑制了抗體和NC膜檢測線上AF－BSA偶聯物的結合。如果樣本中黃曲霉素總含量大于0.5 ug/L，檢測線不顯顏色，結果為陽性；反之，檢測線顯紅色，結果為陰性。
2. 設備和試劑配置
3. 分析步驟：中藥材粉碎溶解后取上清液檢測。吸取樣品滴加到加樣孔中，8-15分鐘讀取結果。在C線顯色的情況下：T 線顯色比C線深或一樣深是陰性。T 線顯色比C線淺，或無顯色是陽性結果。
五、 溫馨TIPS：
1. 中藥中真菌生長繁殖的有利條件主要是適宜的溫度與水分。如能將中藥貯存于10℃以下，水分保持在10％以下，就能有效地防霉。
2. 從事真菌毒素科研及檢測的人員，必須注意防護，如穿戴隔離衣帽，在進行真菌分離培養(yǎng)工作時，應戴口罩，并盡量防止孢子飛揚。
3. 操作臺面如有漏濺，應立即用新配的5％次氯酸鈉消毒。以5％次氯酸鈉（NaOCl）處理時，黃曲霉毒素于數秒鐘內即被破壞，故是常用的消毒劑。
4. 也有應用生物學方法解毒的報道，生物學方法成本低，收效大，可能是一種有前途的除毒措施。
鑒于霉菌毒素對人體的危害，提醒各位奮斗在抗毒一線的老師們一定要注意保護自身安全哦！
中藥材是中醫(yī)防病治病的重要基礎。中藥材在田間生長、采收加工、儲藏運輸等各個環(huán)節(jié)都會因污染霉菌而發(fā)生霉變。這些霉菌分泌的有毒代謝產物使中藥材發(fā)霉變質，直接威脅到群眾的用藥安全。中藥中的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素，赭曲霉素，玉米赤霉烯酮，展青毒素，伏馬毒素等。中藥材的種類是影響真菌毒素污染的主要因素,易污染的中藥材,在不同的溫、濕度條件下均可產生真菌毒素。溫度和濕度條件也可以影響真菌毒素的增長,如：黃曲霉毒素在不同的溫、濕度條件下均可以產生；赭曲霉毒素需要在濕度較高的條件下才能產生。
近年來,隨著中藥材在國際市場上的持續(xù)升溫,其安全性越來越引起人們的關注。真菌毒素殘留作為中藥材微量外源性有毒有害物質,一般不表現出急性毒性,但通常有較強的蓄積性,致癌、致畸、致突變作用明顯,嚴重影響中藥材的安全性。
二、 中藥材真菌毒素控制相關國家法規(guī)
近年來，各級食品藥品監(jiān)管部門不斷加大中藥監(jiān)管力度，努力保持中藥質量總體穩(wěn)定。
國家食品藥品監(jiān)督管理局關于規(guī)范中藥生產經營秩序嚴厲查處違法違規(guī)行為的通知（國食藥監(jiān)安[2012]187號文件）中，要求加強對黃曲霉毒素、重金屬及有害元素、農藥殘留量等安全性指標的檢測和控制，切實保證中藥材質量和安全，另要求企業(yè)具備與生產品種相適應的檢驗設備和能力，嚴把質量檢驗關。
《國家藥品安全“十二五”規(guī)劃》，規(guī)劃中明確指出“開展藥品快速檢驗技術研究，搭建檢驗技術共享平臺”、“加快推進藥品快速檢驗技術在基層的應用，配置快速檢驗設備”，“加強縣級機構快速檢驗能力建設”的要求。
三、 中藥材真菌毒素檢測項目及限量標準
國家食品藥品監(jiān)督管理局對柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎等14味藥材及其飲片品種項下增加“黃曲霉毒素”檢查項目，限度為“黃曲霉毒素B1不得過5 μg/kg；黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2總量不得過10 μg/kg”。
2010 版《藥典》附錄IX V 黃曲霉毒素測定采用高效液相色譜法，另外增補藥典描述該法檢測建立增加柱后光化學衍生法。
四、 中藥材黃曲霉素檢測方案介紹
（一） 儀器分析法
特點
| 優(yōu)點 | 缺點 |
| 準確、靈敏、抗干擾性強，國家檢測部門的確證方法。 | 儀器成本高、對操作人員技術要求高、操作復雜、耗時較長。 |
1. 設備和耗材配置
| 序號 | 品名 | 規(guī)格及參數 | 數量 | 用途 |
| 1 | 高效液相色譜儀 | 一臺 | 分析檢測 | |
| 2 | 熒光檢測器 | 一臺 | 讀取熒光信號 | |
| 3 | 真菌毒素專用色譜柱 | 150/250mm 貨號：PRC-18 |
一支 | 配套各類色譜儀，霉菌毒素檢測用 |
| 4 | GuanyiBio®黃曲霉毒素總量免疫親和柱 | 3ml，25支/盒，快速過柱型， 貨號：IAC-011-3 |
若干 | 高特異性，純化樣本 |
| 5 | GuanyiBio®KRC光化學柱后衍生反應裝置 | 貨號：EQ-KRC | 一臺 | 適用于黃曲霉毒素檢測 |
| 6 | 高速均質器 | 達到22000rpm 以上，貨號：EQ-WR-1L | 一臺 | 耐腐蝕，高速，均質 |
| 7 | GuanyiBiot®玻璃纖維濾紙 | 100P,110mm，1.5μm 貨號：GMF-110 |
一盒 | 霉菌毒素專用過濾 |
| 8 | GuanyiBio®八位泵流操作架 | 貨號：EQ-PUMP-8 | 一臺 | 用于控制免疫親和柱過柱流速 |
| 9 | 黃曲霉毒素混標 | 2µg/ml黃曲霉毒素B1, G1;0.5µg/ml黃曲霉毒素B2;G2 (4/1/4/1)溶于乙腈, 貨號：STD#1081 |
1ml | 用于定量分析標準品的配制 |
3. 免疫親和柱凈化:
富集--洗滌--洗脫--收集全部洗脫液供化學衍生檢測用。
4. 化學衍生
為什么使用光化學衍生器？ 由于黃曲霉具有較強的紫外吸收和產生熒光的特性，因此可以進行HPLC-紫外或熒光檢測，但是同時黃曲霉毒素中的B1、G1 由于其在含水的流動相中容易產生熒光淬滅，因此在很多的實驗中都會采用衍生法測定黃曲霉毒素。衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在線的，由于在線的柱后光化學衍生有明顯的優(yōu)勢，所以現在被增補為藥典的檢測方法，優(yōu)勢主要在于無需任何化學試劑、對人員無傷害；無需人員直接操作、避免誤差; 無需擔心衍生液腐蝕檢測器。
5. 高效液相色譜分析
 |
冠一 KRC光化學衍生器 波長：254 nm HPLC-色譜柱 ：黃曲霉毒素專用C-18色譜柱 150 x 4.6 mm; 流 動 相 ：甲醇-水 45:55 流 速 ： 1.0 mL/min 柱 溫 ： 35 °C 進 樣 體 積 ： 20μL 熒光檢測器：λ-激發(fā)波長：365nm λ-發(fā)射波長：455 nm HPLC配置；高效液相色譜儀帶有熒光檢測器；黃曲霉毒素專用色譜柱 C18 150 x 4.6 mm |
特點
| 優(yōu)點 | 缺點 |
| 靈敏度高、耗時較短、樣本處理比較簡單、對技術人員要求不高、檢測成本低、可同時檢測大批量樣本。適用于大量樣本快速定量篩查。 | 可能存在一定假陽性率（交叉反應率）。 |
1. 方法原理
采用直接競爭酶聯免疫法，在微孔板上預包被黃曲霉毒素抗原，加入樣本（或黃曲霉毒素標準品溶液）及辣根過氧化物酶標記的黃曲霉毒素特異抗體。樣本或標準品溶液中的抗原與預包被在板孔上的抗原競爭結合酶標抗體。未結合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣品吸光值與其所含黃曲霉毒素總量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣品中黃曲霉毒素總量的含量。
2. 設備和試劑配置：
| 序號 | 品名 | 規(guī)格及參數 | 數量 | 用途 |
| 1 | GuanyiBioR黃曲霉毒素總量試劑盒 | 96T，靈敏度：0.1ppb 貨號：EKT-011 |
一盒 | 定量分析檢測 |
| 2 | GuanyiBio離心小柱 | 25T | 一盒 | 凈化樣本 |
| 3 | 酶標儀（酶聯免疫檢測儀） | 濾光片：450nm | 一臺 | 配套各類色譜儀，霉菌毒素檢測用 |
為什么要用GuanyiBio離心小柱？中藥材的基質復雜，提取時樣本液顏色較深，而且不容易去除。有機試劑提取凈化方法繁瑣，試劑揮發(fā)對環(huán)境及人體造成危害，且凈化效果不穩(wěn)定。用GuanyiBio離心小柱，則只需提取液離心過柱，即可去除提取液中的雜質，方便快捷，凈化效果好，且回收率可以達到85%以上。
4. 檢測步驟
4.1 免疫反應30min；洗板5次；顯色反應30min；終止反應，酶標儀讀OD值。
5. 分析結果的表述
用酶標儀判讀結果。
（三）免疫金標快速檢測法
特點
| 優(yōu)點 | 缺點 |
| 操作簡單、費用低廉、耗時短、檢測快速。適用于樣本快速定性初步篩查 | 存在一定假陽性、數據不方便保存及分析。 |
1. 方法原理
黃曲霉毒素總量快速檢測條應用了競爭抑制免疫層析的原理，樣本中的黃曲霉毒素總量在酶標孔中與膠體金標記的特異性抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合，抑制了抗體和NC膜檢測線上AF－BSA偶聯物的結合。如果樣本中黃曲霉素總含量大于0.5 ug/L，檢測線不顯顏色，結果為陽性；反之，檢測線顯紅色，結果為陰性。
2. 設備和試劑配置
| 序號 | 品名 | 規(guī)格及參數 | 數量 | 用途 |
| 1 | GuanyiBioTM黃曲霉毒素總量免疫金標快速檢測條 | 25T 檢測限：10ppb 貨號：PR-011 |
一盒 | 定性分析檢測 |
五、 溫馨TIPS：
1. 中藥中真菌生長繁殖的有利條件主要是適宜的溫度與水分。如能將中藥貯存于10℃以下，水分保持在10％以下，就能有效地防霉。
2. 從事真菌毒素科研及檢測的人員，必須注意防護，如穿戴隔離衣帽，在進行真菌分離培養(yǎng)工作時，應戴口罩，并盡量防止孢子飛揚。
3. 操作臺面如有漏濺，應立即用新配的5％次氯酸鈉消毒。以5％次氯酸鈉（NaOCl）處理時，黃曲霉毒素于數秒鐘內即被破壞，故是常用的消毒劑。
4. 也有應用生物學方法解毒的報道，生物學方法成本低，收效大，可能是一種有前途的除毒措施。
鑒于霉菌毒素對人體的危害，提醒各位奮斗在抗毒一線的老師們一定要注意保護自身安全哦！
