Sapphire激光掃描成像在CMG解旋酶與前導(dǎo)鏈DNA聚合酶協(xié)同機(jī)制研究應(yīng)用

真核生物中，Cdc45-MCM-GINS （CMG解旋酶）與DNA聚合酶（Polε）的緊密耦合，是驅(qū)動(dòng)復(fù)制起始、維持分叉進(jìn)程的前提。然而，二者在復(fù)制叉上的活動(dòng)機(jī)制在很大程度上尚未可知。

近日，香港大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院領(lǐng)銜在Nature Communication上發(fā)表了題為Synergism between CMG helicase and leading strand DNA polymerase at replication fork的研究文章。通過對酵母前導(dǎo)鏈復(fù)制體的一系列研究，前所未有地闡明了一種CMG解旋酶與Polε的協(xié)同工作機(jī)制，及其協(xié)調(diào)DNA解螺旋及合成的動(dòng)態(tài)圖景。
 

1 酵母前導(dǎo)鏈復(fù)制體的整體結(jié)構(gòu)
作者組裝了一個(gè)前導(dǎo)鏈復(fù)制體復(fù)合物，并用低溫電鏡技術(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，在此復(fù)制體結(jié)構(gòu)中，CMG解旋酶作為核心，將Tof1-Csm3組裝到MCM環(huán)Mcm6/4/7側(cè)的NTD面，將Ctf4同源三聚體組裝到Cdc45和GINS的界面上，而Polε則與MCM環(huán)Mcm2/5/3側(cè)的GINS和CTD面結(jié)合(補(bǔ)充圖2a-e)。從MCM環(huán)的NTD層伸出的親本雙鏈DNA被Tof1-Csm3捕獲，并向Mcm6/4/7側(cè)彎曲(補(bǔ)充圖2a, c, d, f)。
 

補(bǔ)充圖2. 前導(dǎo)鏈復(fù)制體的總體結(jié)構(gòu)（a-c）DNA復(fù)制叉上CMG-Polε-Ctf4-Tof1-Csm3復(fù)制體的冷凍電鏡密度圖（側(cè)視圖）。（d，e）復(fù)制體MCM環(huán)的頂部NTD（d）和底部CTD（e）視圖。（f） 與（c）相同，但去除Mcm3和Mcm7以突出MCM環(huán)內(nèi)叉DNA的構(gòu)象。

2 Polε與CMG MCM環(huán)的docking
在復(fù)制體結(jié)構(gòu)中，Polε通過四個(gè)對接位點(diǎn)與CMG相互作用（圖1a-d)。在對接位點(diǎn)(DS) 1上，Polε全酶高柔韌性的Dpb2-NTD(殘基12-98)穩(wěn)定地錨定在GINS Psf1(殘基161-208)的b結(jié)構(gòu)域上。

圖1. Polε與CMG解旋酶互作詳情圖。a–d復(fù)制體的冷凍電鏡密度圖（側(cè)視圖）。

然而， Polε可能不依賴于Dpb2-NTD而被整合到復(fù)制體中。作者構(gòu)建了一個(gè)Dpb2-NTD 敲除的Polε突變體（稱為PolεΔ2N）。體外拉下實(shí)驗(yàn)（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)檢測）顯示，盡管親和力低于野生型，PolεΔ2N仍可與DNA-CMG復(fù)合體進(jìn)行作用（Polε-WT， 圖2a，泳道 6-7）。可見MCM環(huán)介導(dǎo)了Polε與CMG解旋酶的直接結(jié)合，而不依賴于Dpb2-NTD。

有趣的是，在沒有DNA的情況下，PolεΔ2N與CMG復(fù)合體的結(jié)合受到嚴(yán)重抑制(圖2a，泳道11)；然而Polε-WT則表現(xiàn)出很強(qiáng)的CMG結(jié)合親和力(圖2a，泳道10)。此時(shí)，Dpb2-NTD與Psf1的相互作用，成為Polε與CMG耦合的必要條件。同時(shí)也表明，分叉DNA在調(diào)節(jié)Polε進(jìn)入前導(dǎo)鏈復(fù)制體中具有關(guān)鍵作用。
 

圖2a. CMG解旋酶體外拉下實(shí)驗(yàn)（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)拍攝）

3 polε- MCM耦合是復(fù)制起始的必要條件
作者構(gòu)建了一系列刪除MCM結(jié)合域的pol2突變體。結(jié)果顯示，在限制性條件下，同時(shí)敲除DS2和DS4（pol2ΔDS2+4）將導(dǎo)致pol2-iAID細(xì)胞（可條件性耗盡內(nèi)源Pol2- aid融合蛋白）無法存活。

作者接著進(jìn)行體外拉下實(shí)驗(yàn)（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)，圖2a，泳道4-5)。結(jié)果顯示， Pol2ΔDS2突變體中， PolεΔ2N與DNA-CMG復(fù)合體的親和力顯著降低(圖2a, 泳道 8)， Pol2ΔDS2+4中幾乎完全消失(圖2a，泳道9)。

在耗盡內(nèi)源性pol2-aid蛋白后，進(jìn)行Psf2-Flag免疫沉淀分析。在POL2-WT細(xì)胞中，與Psf2-Flag共沉淀的Mcm2和Cdc45僅出現(xiàn)在S期早期；在pol2ΔDS2突變體(圖2e, 泳道5-6)中，共沉淀水平降低；在pol2ΔDS2+4突變體(圖2e, 泳道7-8)中則被抑制。
 

圖2e. Psf2-Flag免疫沉淀實(shí)驗(yàn) （Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)拍攝）

可見，DS2和DS4對于穩(wěn)定Polε與MCM環(huán)的結(jié)合至關(guān)重要，穩(wěn)定的polε- MCM耦合是CMG形成驅(qū)動(dòng)復(fù)制起始的必要條件。

此外，體外解旋酶實(shí)驗(yàn)中（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)檢測），無Polε存在時(shí)，CMG解旋酶可有效解螺旋分叉的雙鏈DNA (圖6b, d)，Polε存在時(shí)，只表現(xiàn)出輕微的CMG活性抑制(圖6c, d)，表明Polε結(jié)合對CMG活性幾乎沒有影響。

體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)檢測）顯示，與polε-WT的高水平全長產(chǎn)物相比，PolεΔDS2的復(fù)制效率降低，PolεΔDS2+4沒有明顯的DNA合成(圖6g)。不加CMG的對照組中，只有極低水平的DNA合成產(chǎn)物。說明Polε與CMG解旋酶的耦合有助于在前導(dǎo)鏈的復(fù)制延申。
 

圖6. b-c. 有無Polε情況下，CMG解旋酶的非變形PAGE分析 d. 復(fù)制叉解螺旋效果 f. 純化的DNA復(fù)制相關(guān)因子，SDS-PAGE考染顯色分析 g. 復(fù)制產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠實(shí)驗(yàn)（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)拍攝）

綜上所述，本研究闡明了復(fù)制體的一種內(nèi)在機(jī)制，通過協(xié)調(diào)CMG和Polε的活動(dòng)，能夠解決復(fù)制叉易位過程中的各種障礙、DNA損傷及表觀遺傳標(biāo)記。這種解旋酶與DNA聚合酶的周期性耦合機(jī)制，或是生物體用于高保真復(fù)制基因組的有效策略。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-41506-0

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