常見的細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)介紹

1、什么是細(xì)胞培養(yǎng)？ 細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞從動(dòng)物或植物體內(nèi)取出，然后在適宜的人工環(huán)境中生長的過程。細(xì)胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可以來源于已建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。
（1）原代培養(yǎng)
原代培養(yǎng)是指細(xì)胞從組織中分離出來后，在適宜條件下增殖，直到它們占據(jù)所有可用的基質(zhì)（即達(dá)到匯合狀態(tài)）的培養(yǎng)階段。在此階段，必須通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有新鮮生長培養(yǎng)基的新容器中進(jìn)行繼代培養(yǎng)（即傳代），以為其提供更多的繼續(xù)生長空間。
（2）細(xì)胞系
第一次傳代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物即被稱為細(xì)胞系。來自于原代培養(yǎng)的細(xì)胞系壽命有限，隨著細(xì)胞的傳代，生長能力最強(qiáng)的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞群體在基因型和表型上達(dá)到一定程度的均一性。
（3）細(xì)胞株
如果通過克隆或其他方法從培養(yǎng)物中陽性篩選出了細(xì)胞系的亞群，則該細(xì)胞系成為一個(gè)細(xì)胞株。與親代細(xì)胞系起始時(shí)相比，細(xì)胞株通常會(huì)獲得一些其他的遺傳學(xué)改變。
2、細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用 細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)所使用的一項(xiàng)重要技術(shù)，為細(xì)胞正常生理和生化研究（如代謝研究、衰老研究）、藥物和毒性化合物對(duì)細(xì)胞的作用、以及致突變性和致癌性研究提供了上佳的模型系統(tǒng)。細(xì)胞培養(yǎng)還可用于藥物篩選和開發(fā)，以及生物化合物（如疫苗、治療性蛋白質(zhì)）的大規(guī)模生產(chǎn)。
在這些應(yīng)用中，使用細(xì)胞培養(yǎng)的一大優(yōu)勢(shì)在于，使用來源于同一克隆的一批細(xì)胞可獲得穩(wěn)定一致、可重復(fù)的結(jié)果。
3、細(xì)胞的形態(tài) 根據(jù)細(xì)胞的形狀和外觀（即形態(tài)），可將其分為三大類。
（1）成纖維（或成纖維細(xì)胞樣）細(xì)胞是雙極或多極細(xì)胞，呈細(xì)長的形狀，并附著在基質(zhì)上生長。
（2）上皮樣細(xì)胞呈多邊形，尺寸更規(guī)則，并附著在基質(zhì)上分呈散在斑片狀生長。
（3）淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞呈球形，通常懸浮而不附著于表面生長。
4、細(xì)胞培養(yǎng)的方式
（1）貼壁培養(yǎng)
貼壁培養(yǎng)主要適用于貼壁依賴性細(xì)胞。此類需要相互依賴，需貼附于不起化學(xué)作用的物質(zhì)（玻璃或塑料等無活性物質(zhì)）的表面生長、生存和維持，并終在附著面生長至單層，鋪滿平面時(shí)便會(huì)發(fā)生接觸抑制。
（2）懸浮培養(yǎng)
來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，及許多腫瘤細(xì)胞（包括雜交瘤細(xì)胞）和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞等屬于懸浮培養(yǎng)型細(xì)胞，細(xì)胞為非貼壁依賴性細(xì)胞，無需支撐面，細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖。
5、常用的細(xì)胞類型舉例
（1）293細(xì)胞
很常用的表達(dá)研究外源基因的細(xì)胞株。細(xì)胞總體上分為293T和293F兩種類型，293T貼壁培養(yǎng)，293F懸浮培養(yǎng)。
來源：人體腎臟
形態(tài)：上皮細(xì)胞
注釋：該細(xì)胞含腺病毒5DNA
培養(yǎng)液：MEM，10%FBS
傳代：吸去培養(yǎng)液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清會(huì)抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：2到1：4為宜，傳代期間培養(yǎng)液2-3天更換1次）
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
（2）CHO-K1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中常用細(xì)胞株，在生物制藥中使用也非常廣泛。該細(xì)胞株培養(yǎng)條件簡單，貼壁強(qiáng)度適中，比較容易轉(zhuǎn)染，很適合用它來研究一般哺乳動(dòng)物基因的功能。
來源：Cricetulusgriseus(中國倉鼠)卵巢
形態(tài)：表皮細(xì)胞
注釋：CHO-K1由CHO衍生而來，CHO是T.T.Puck在1957年從一只成年中國倉鼠卵巢獲得的。
培養(yǎng)液：F-12，10%FBS
傳代：吸去培養(yǎng)液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清會(huì)抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：4到1：8為宜，傳代期間培養(yǎng)液更換1-2次）
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
（3）Vero細(xì)胞 Vero細(xì)胞成功用來培養(yǎng)狂犬病疫苗、乙腦疫苗等多種疫苗，在非典期間又為研究冠狀病毒做出貢獻(xiàn)，在醫(yī)藥研究種廣泛應(yīng)用。
來源：非洲綠猴腎細(xì)胞
形態(tài)：上皮細(xì)胞
注釋：該細(xì)胞是日本千葉大學(xué)的Y.Yasumura和Y.Kawakita于1962年3月27日從一只正常的成年非洲綠猴腎組織培養(yǎng)出來的。
培養(yǎng)液：MEM，10%FBS
傳代：吸去培養(yǎng)液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清會(huì)抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：3至1：6為宜，傳代期間培養(yǎng)液每周更換2-3次）
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮
（4）Hela細(xì)胞 Hela細(xì)胞是在所有細(xì)胞株中最著名的。它來源于美國的HelenLane，1951年死于子宮頸癌。但源自她的腫瘤的細(xì)胞卻在世界各地的實(shí)驗(yàn)室中得到廣泛的使用。
來源：人宮頸癌 
形態(tài)：上皮細(xì)胞 
注釋：Hela細(xì)胞顯角蛋白免疫沉淀染色陽性，包含HPV-18序列，有正常水平的pRB和p53的低水平表達(dá)。
培養(yǎng)液：MEM，10%FBS
傳代：吸去培養(yǎng)液。用0.25%（w/v）Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清會(huì)抑制胰酶活性）。加2-3毫升Trypein-EDTA，放37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：2到1：6為宜，每周傳代2-3次）
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
（5）Sf9細(xì)胞 Sf9細(xì)胞常在Baculovirus（桿狀病毒）表達(dá)系統(tǒng)中用作宿主細(xì)胞，來表達(dá)外源蛋白。
來源：敘利亞倉鼠腎細(xì)胞
形態(tài)：纖維原細(xì)胞
生長特性：貼壁/懸浮
注釋：這個(gè)細(xì)胞來自于一只出生一天的新生倉鼠，隨后被改造成一個(gè)易于作表達(dá)的宿主細(xì)胞株。
培養(yǎng)液：TNM-FH，10%FBS
傳代：每隔一天用新鮮的培養(yǎng)基將其稀釋到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
（6）HepG2細(xì)胞 HepG2細(xì)胞來源于一個(gè)15歲白人的肝癌組織。該細(xì)胞分泌多種血漿蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細(xì)胞能大容量培養(yǎng)，乙肝表面抗原陰性，對(duì)G418有抗性，對(duì)人生長激素有刺激反應(yīng)。
來源：人肝癌細(xì)胞
形態(tài)：上皮細(xì)胞
生長特性：貼壁
注釋：該細(xì)胞表達(dá)3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。該細(xì)胞在有百草枯(英文名：gramoxone)的環(huán)境下過氧化氫酶mRNA表達(dá)增加，ApoA-ImRNA表達(dá)減少。
培養(yǎng)液：MEM，10%FBS。
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
6、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境
細(xì)胞培養(yǎng)基是培養(yǎng)環(huán)境中最重要的組成部分，因?yàn)樗鼮榧?xì)胞生長提供了必要的營養(yǎng)、生長因子和激素，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值和滲透壓。
（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基
大多數(shù)細(xì)胞系在含有氨基酸、維生素、無機(jī)鹽和碳源（例如葡萄糖）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長良好，但在這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方中必須進(jìn)一步添加血清。
（2）減血清培養(yǎng)基
在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，減少血清不良影響的另一種策略是使用減血清培養(yǎng)基。減血清培養(yǎng)基是富含營養(yǎng)物質(zhì)和動(dòng)物源性因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，可減少所需的血清量。
（3）無（免）血清培養(yǎng)基
無血清培養(yǎng)基（SFM）通過用適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)和激素配方替代血清，避免了使用動(dòng)物血清的問題。無血清培養(yǎng)基配方適用于許多原代培養(yǎng)物和細(xì)胞系，包括用于生產(chǎn)重組蛋白的中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系、各種雜交瘤細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系Sf9和Sf21（草地貪夜蛾）以及用作病毒生產(chǎn)宿主的細(xì)胞系（例如293、VERO、MDCK、MDBK等）。使用無血清培養(yǎng)基的主要優(yōu)勢(shì)之一是，能夠通過選擇生長因子的適當(dāng)組合使培養(yǎng)基對(duì)特定細(xì)胞類型具有選擇性。
7、細(xì)胞培養(yǎng)基的各成分以及理化性質(zhì)
細(xì)胞培養(yǎng)基必須含有充分的營養(yǎng)物質(zhì)，才能滿足新細(xì)胞合成、細(xì)胞代謝等生化反應(yīng)所需要的物質(zhì)和能量。細(xì)胞培養(yǎng)基的主要成份是水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助營養(yǎng)物質(zhì)等。此外，還可能含有血清、血清替代成分、pH指示劑等。
（1）水
水是細(xì)胞的主要成分，也是細(xì)胞賴以生存的主要環(huán)境。細(xì)胞培養(yǎng)液中90%以上的成份是水。細(xì)胞對(duì)水的品質(zhì)非常敏感，水的品質(zhì)將直接影響細(xì)胞培養(yǎng)的效果。而水中通常含有重金屬、氯、磷、有機(jī)物、熱原等污染物，細(xì)胞培養(yǎng)用水須經(jīng)過純化，品質(zhì)應(yīng)符合中國藥典注射用水標(biāo)準(zhǔn)或者超純水的標(biāo)準(zhǔn)。
（2）能源和碳源
能源和碳源是用于維持細(xì)胞生命和支持細(xì)胞生長，主要包括糖、糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺，其他氨基酸是次要的能源和碳源物質(zhì)。細(xì)胞能夠利用的糖類主要是六碳糖，目前大多體外培養(yǎng)時(shí)選取葡萄糖作為細(xì)胞的主要碳源和能量來源，因此細(xì)胞培養(yǎng)基中基本都含有葡萄糖，含量一般為5～25mmol/L。
在葡萄糖濃度較高時(shí)，細(xì)胞主要通過擴(kuò)散作用吸收葡萄糖，細(xì)胞膜內(nèi)外的葡萄糖濃度梯度是細(xì)胞吸收葡萄糖的動(dòng)力；在葡萄糖濃度較低時(shí)，主要由鈉離子推動(dòng)的高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)過程使細(xì)胞攝取葡萄糖。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后參與糖酵解、核酸代謝、糖原合成、能量代謝以及一些氨基酸的合成。與體內(nèi)的能量供應(yīng)途徑不同，體外培養(yǎng)時(shí)，一定的濃度范圍條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解循環(huán)轉(zhuǎn)化成乳酸來為細(xì)胞提供能量。
（3）氮源（氨基酸）
氨基酸在細(xì)胞內(nèi)的重要生理作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
①是蛋白質(zhì)的基本組成單位，用于合成蛋白質(zhì)和多肽；
②可用于合成某些具有重要生理作用的含氮化合物，如核酸、尼克酰胺等；
③某些氨基酸還具有獨(dú)特的生理作用，如甘氨酸參與生物轉(zhuǎn)化作用，丙氨酸和谷氨酰胺參與細(xì)胞內(nèi)氨的運(yùn)輸?shù)龋?br /> ④可轉(zhuǎn)變成糖類和脂肪，參與氧化供能。
絕大部分細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺有較高的要求，可能因其不僅是細(xì)胞的主要氮源，且可作為細(xì)胞生長的能源物質(zhì)和嘌呤、嘧啶核苷酸的前體，另外還可直接作為細(xì)胞增殖和產(chǎn)物合成中的蛋白質(zhì)和多肽的組成成分。在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞會(huì)生長不良，甚至死亡。由于谷氨酰胺具有多種生理作用，體外動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需要大量谷氨酰胺，利用量常超過其他必須氨基酸利用量的總和。
（4）維生素
維生素是維持細(xì)胞生長的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。維生素可分為水溶性和脂溶性兩類，水溶性維生素主要包括泛酸、維生素B12、葉酸、煙酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黃素、維生素C、膽堿、肌醇等；脂溶性維生素主要包括維生素A、D、E、K等；有的培養(yǎng)液中還直接采用ATP和輔酶A；大部分培養(yǎng)基中還有生物素。
許多維生素參與構(gòu)成各種酶的活性基團(tuán)的成分，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動(dòng)將無法進(jìn)行。比如，泛酸可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成�；�載體蛋白和輔酶（如輔酶A），參與糖類、脂類和蛋白質(zhì)代謝中的催化反應(yīng)；維生素B12則在細(xì)胞內(nèi)參與葉酸的合成和脂肪酸的合成等。不同配方的細(xì)胞培養(yǎng)基中維生素的濃度有較大差異。
（5）無機(jī)鹽
無機(jī)鹽是細(xì)胞維持生命活動(dòng)所不可缺少的營養(yǎng)成分，主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl－、PO43-、SO42-、HCO3－等，主要作用為維持細(xì)胞培養(yǎng)液滲透壓平衡，參與細(xì)胞的代謝活動(dòng)。此外，通過提供鈉，K+和Ca2+，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能。Na+是細(xì)胞外液中最主要的陽離子，對(duì)維持滲透壓的恒定有決定性的作用，還與Cl－共同參與生物電活動(dòng)、維持水平衡和酸堿平衡等。K+主要分布在細(xì)胞內(nèi)液，對(duì)于激活某些酶是必需的，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+和Mg2+主要參與信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝、脂肪酸合成、核糖體穩(wěn)定和蛋白質(zhì)合成等多種生理作用。PO43－、SO42－、HCO3－是基質(zhì)所需陰離子，同時(shí)是細(xì)胞內(nèi)電荷的調(diào)節(jié)者。磷對(duì)于細(xì)胞的生長、代謝和調(diào)控都有重要的作用，含磷的化合物如核酸、磷脂、蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞的主要成分，ATP、ADP是能量生成、存儲(chǔ)和利用的不可或缺的化合物。
此外，微量元素如鐵、鈷、鎳、硒、碘、銅、鋅、錳、鉻、鉬、氟等對(duì)于細(xì)胞生長代謝和產(chǎn)物合成都有促進(jìn)作用。
（6）其他添加成分
在低血清、無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中，為滿足細(xì)胞生長增殖需要，常常添加一些成份：蛋白質(zhì)、多肽、核苷、嘌呤、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、脂類、及一些血清替代因子等。其中蛋白質(zhì)具有重要的作用，動(dòng)物細(xì)胞對(duì)許多物質(zhì)（難溶于水的離子或脂類物質(zhì)）的攝取需要借助蛋白質(zhì)的傳遞作用，如白蛋白、傳遞蛋白、貼壁蛋白等能夠攜帶脂肪酸、激素、礦物質(zhì)等促進(jìn)細(xì)胞生長。轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種重要的傳遞蛋白，能夠結(jié)合鐵，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)鐵離子的吸收，并具有解毒作用，其促生長作用可能與其具有生長因子的功能有關(guān)。胰島素可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖和氨基酸的利用，商業(yè)化中一些生長因子以重組蛋白形式添加到培養(yǎng)基中，主要用來刺激細(xì)胞增殖，并可促進(jìn)糖元和脂肪酸的合成。乙醇胺是一種重要的刺激細(xì)胞生長的化合物，是腦磷酸的合成前提。
（7）保護(hù)劑
細(xì)胞保護(hù)劑是保護(hù)細(xì)胞免受滲透壓變化、剪切力、氧化及氣泡作用等引起的損傷的物質(zhì)。在使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞易被機(jī)械攪拌和通氣鼓泡產(chǎn)生的流體剪切力和氣泡作用所傷害甚至破損死亡。為降低這種損傷，除優(yōu)化生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)工藝外，可在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加一些保護(hù)劑。其主要是通過改變細(xì)胞培養(yǎng)基物性或是對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用的物質(zhì)，常用的種類有血清、白蛋白、聚乙二醇（PEG）、非離子性表面活性劑PluronicF68或是其他一些高分子聚合物等。
（8）pH值
動(dòng)物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，適宜pH在7.2～7.4之間。細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值通常需經(jīng)校正的pH計(jì)來測(cè)定。在細(xì)胞生長過程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動(dòng)的加強(qiáng)，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，pH值發(fā)生變化。酚紅是細(xì)胞培養(yǎng)基中最常用的pH指示劑，但依靠細(xì)胞培養(yǎng)基中的酚紅等pH指示劑進(jìn)行判斷，需要實(shí)驗(yàn)員的經(jīng)驗(yàn)積累，存在較大的主觀性。實(shí)際上，個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基或是無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中酚紅含量較少或是不含酚紅，只能通過pH計(jì)或者pH電極進(jìn)行pH值的檢測(cè)，結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。
（9）緩沖能力/CO2
細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)具有一定的緩沖能力。細(xì)胞培養(yǎng)過程中造成細(xì)胞培養(yǎng)液pH波動(dòng)的主要物質(zhì)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2。在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，細(xì)胞培養(yǎng)液pH很快下降；打開培養(yǎng)器具時(shí)CO2逸出則會(huì)引起pH升高。細(xì)胞培養(yǎng)基通常采用NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，按下列化學(xué)反應(yīng)方程式調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值：
H2O+CO2 →H2CO3 ⇌H++HCO3－
NaHCO3 ⇌Na+ +HCO3－
此外，還有緩沖能力較高的磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。但碳酸鹽緩沖系統(tǒng)的細(xì)胞毒性小、成本低，在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用得更為廣泛。另一種較為常用的緩沖液是HEPES（羥乙基哌嗪乙硫磺酸）液，它是一種非離子兩性緩沖液，在pH7.0~7.2范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力。高濃度的HEPES可能對(duì)細(xì)胞有毒性作用，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)HEPES的添加濃度一般為10～25mmol/L。
（10）溫度
溫度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基有較大的影響，溫度過高可引起營養(yǎng)成份的降解或破壞，細(xì)胞培養(yǎng)基的pH、離子強(qiáng)度和電解常數(shù)pKa也可能受到影響。如細(xì)胞培養(yǎng)液中的谷氨酰胺，在高溫條件下降解的速度較快，如35℃貯存時(shí)，放置3天降解25%左右，在4℃貯存3周降解約20%。
（11）粘滯性及表面張力
含血清細(xì)胞培養(yǎng)液的粘滯性主要是由血清引起的，在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)貼壁細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液的粘滯性對(duì)細(xì)胞生長沒有多大影響；但在生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液的粘滯性則直接影響攪拌轉(zhuǎn)速控制及攪拌剪切力對(duì)細(xì)胞造成的損傷程度。
表面張力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有較大的作用，尤其在利用生物反應(yīng)器進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)，攪拌和通氣都會(huì)引起泡沫的產(chǎn)生。對(duì)于含血清培養(yǎng)液，由于血清中多種蛋白的存在，攪拌時(shí)產(chǎn)生的氣泡較多，氣泡的上升運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞的損傷程度還有爭議，但氣泡的破裂對(duì)細(xì)胞有明顯的損傷作用。為降低這種損傷，可通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加一些保護(hù)劑，降低細(xì)胞-氣體和細(xì)胞-液體的表面張力，減少氣泡的形成。
（12）不同細(xì)胞培養(yǎng)基的除菌方式及注意事項(xiàng)
細(xì)胞培養(yǎng)基滅菌的方式分為高壓滅菌和膜過濾除菌，不同的培養(yǎng)基由于其營養(yǎng)成份不同，滅菌方式也可能不同。
①高壓滅菌
某些培養(yǎng)基（如MEM）可進(jìn)行高壓滅菌，這類培養(yǎng)基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，一般是在培養(yǎng)基高壓滅菌后才加入。另外可用耐高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）代替L-谷氨酰胺�？筛邏簻缇�的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達(dá)到滅菌效果及營養(yǎng)成分的最小損失，不需將滅菌時(shí)間延長。
②膜過濾除菌
絕大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基不適宜高壓滅菌，因培養(yǎng)液中常含有維生素、蛋白質(zhì)、多肽、生長因子等物質(zhì)，這些物質(zhì)在高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失去功能，因而上述液體多采用過濾消毒以除去細(xì)菌�？晒┻^濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone（PES）、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。膜過濾除菌是當(dāng)前較為常用及便捷的一種方法，常采用0.2μm孔徑的濾膜，部分采用0.1μm孔徑。與高壓過濾方式相比，濾膜具有使用期限且價(jià)格較高，但對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份破壞性較小。
8、細(xì)胞培養(yǎng)基中重要的幾種添加成份
（1）D-葡萄糖（D-Glucose）
作用：細(xì)胞生長所需的主要能量來源。
①最初的DMEM中，葡萄糖濃度為1g/L，現(xiàn)在稱其為低糖型DMEM，適合培養(yǎng)代謝作用較慢、依賴性貼壁細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
②高糖型DMEM中的葡萄糖濃度為4.5g/L，普遍應(yīng)用于生長快、粘附性低的細(xì)胞、雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞、克隆細(xì)胞、DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、原代病毒宿主細(xì)胞、單一細(xì)胞的培養(yǎng)以及疫苗的生產(chǎn)，例如利用CHO細(xì)胞表達(dá)EPO和生產(chǎn)乙肝疫苗。
③使用無糖培養(yǎng)基的主要目的是，通過控制細(xì)胞的能量來源，研究細(xì)胞的代謝過程或葡萄糖利用效率。
（2）L-谷氨酰胺（L-glutamine）
作用：L-谷氨酰胺是一種氨基酸，細(xì)胞的重要能量來源，參與蛋白質(zhì)的合成，也為合成核酸提供碳源。
存在的問題：
①L-谷氨酰胺不穩(wěn)定，在中性的水溶液中會(huì)自發(fā)降解。
②降解產(chǎn)物氨對(duì)細(xì)胞有毒性。
③對(duì)氨敏感的細(xì)胞（如干細(xì)胞和原代細(xì)胞等）或培養(yǎng)環(huán)境（高密度反應(yīng)器，無補(bǔ)料的長期培養(yǎng)）不推薦含L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基。
解決方案：
①選擇不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基，使用前自行添加L-谷氨酰胺。
②谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50%，使用中最好單獨(dú)配制，置-20℃冰箱中保存，使用前加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。
（3）丙酮酸鈉（Sodiumpyruvate）
作用：能量來源
①丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。
②葡萄糖不足的時(shí)候，細(xì)胞可以代謝丙酮酸鈉。
③保證細(xì)胞更好地生長。
④非必需組分。
（4）HEPES
作用：pH緩沖劑。
①是一種氫離子緩沖劑，其作用不依賴于二氧化碳。
②在一定范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞無毒性作用，能較長時(shí)間控制恒定的pH范圍，保證細(xì)胞良好生長。
③部分細(xì)胞對(duì)酸堿度的變化非常敏感，建議使用含有HEPES的培養(yǎng)基。
④添加后價(jià)格相對(duì)較高，非必需。
（5）酚紅（Phenolred）
作用：pH值指示劑，pH值低時(shí)培養(yǎng)基呈黃色，pH值高時(shí)培養(yǎng)基呈紫色，pH值7.2～7.4時(shí)為紅色，最適合細(xì)胞培養(yǎng)。
①在一些無血清培養(yǎng)基的配方中酚紅會(huì)干擾鈉-鉀平衡培養(yǎng)，干細(xì)胞或細(xì)胞克隆時(shí)傾向于不加酚紅。
②酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），在培養(yǎng)雌激素敏感的細(xì)胞（如乳腺組織）時(shí)，建議使用不含酚紅的培養(yǎng)基。
③酚紅的顏色會(huì)對(duì)流式細(xì)胞分析產(chǎn)生一定的干擾，不建議使用含酚紅的培養(yǎng)基制備細(xì)胞樣品。
（6）碳酸氫鈉（Sodiumbicarbonate）
作用：pH緩沖劑。
①pH6.8-7.8為細(xì)胞生長的最佳pH條件，多數(shù)培養(yǎng)基利用碳酸氫鈉進(jìn)行緩沖。
②碳酸氫鈉的緩沖需要二氧化碳。高碳酸氫鈉(1.5-3.7g/L)需要5-10%二氧化碳；低碳酸氫鈉(0.35g/L)不需要二氧化碳培養(yǎng)箱。
③干粉培養(yǎng)基需要在配制時(shí)單獨(dú)添加碳酸氫鈉。