Chorus在助力綠色多肽合成新方向研究中的應用

Chorus助力綠色多肽合成新方向
直到現在，DMF一直被認為是固相多肽合成（SPPS）的金標準。但是因為其毒性強，危險系數高，被列為CMR劑（致癌、致突變或對生殖有毒的溶劑）。在2021年11月22日，歐盟在其官方公報上發(fā)布法規(guī)(EU) 2021/2030，增加第76項關于N,N-二甲基甲酰胺（簡稱DMF或DMFA）的限制條款，正式將DMF納入REACH法規(guī)限制清單。¹  規(guī)定從2023年12月12日起，該物質本身及含有該物質濃度≥0.3% 的物質或混合物不得投放市場。

正是因為這樣，所以亟需找到一種合適的可以替代DMF的方案。世界范圍內的多肽相關研究課題組對多種替代性強、更加環(huán)保的溶劑或混合物進行了廣泛研究，并且對其在SPPS中的潛力進行了評估。^2-5

結果發(fā)現，有兩種替代品具有非常好的應用前景，分別是N-甲基-2-吡咯烷酮（NBP）和二甲基亞砜（DMSO）與乙酸乙酯（EtOAc）的混合物。^3-5 下面，就讓我們一起來看一下它們在SPPS中的實際應用情況吧。

我們在尋找替代DMF的溶液時，通常溶劑的極性和粘度是需要考慮的關鍵因素。²

DMSO/EtOAc混合物的危險性比較小，并且可以通過改變各組分的比例來調整溶劑的極性，以獲得最佳的反應條件，例如Fmoc去除和偶聯。不過，使用二元混合物也會帶來一定的挑戰(zhàn)，例如在SPPS過程中，針對不同反應需要使用不同的溶劑比例進行溶劑輸送。

另一種替代品NBP，這是一種極性鈍化綠色溶劑，在SPPS中具有良好的性能。不過，NBP的粘度較高，難以準確的輸送氨基酸和試劑。

利用自帶的專利矩陣式液體傳輸技術（PurePep Pathway）和感應加熱功能，PurePep Chorus多肽合成儀可以精確可靠地處理各種溶劑并且自由的調整合適的溫度。因此，我們利用它研究了三種不同溶劑系統(tǒng)（DMF、NBP和DMSO/EtOAc）在兩種溫度下（室溫和感應加熱到50℃）對三種模型多肽的粗產率和純度的影響（表1）。

方法
合成
合成三種不同的多肽，分別是Poly-Ala (H-A10K-NH2)、酰基載體蛋白(65-74, ACP, H-VQAAIDYING-OH) 和促性腺激素釋放激素(pyroGlu1→Gly, G-LHRH, H-GHWSYGLRPG-NH2)^6,7三種肽在常溫和高溫（50℃）條件下，使用不同的偶聯劑二異丙基碳二亞胺/氰基羥基亞胺乙酸乙酯（DIC/Oxyma）和 O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽/N-甲基嗎啉（HCTU/NMM），以 0. 1 毫摩爾合成規(guī)模在三種不同溶劑（DMF、NBP 和 DMSO/EtOAc）中進行合成。
 

以 0.1 mmol 的比例在 Fmoc-Lys(Boc)-Wang樹脂 上合成了 PolyAla，在 Fmoc-Gly-Wang 樹脂上合成了 ACP，在 Rink Amide MBHA 樹脂上合成了 G-LHRH。在 DIC/Oxyma 偶聯過程中8使用 0.3 M 氨基酸（6 個當量）、0.4 M Oxyma（8 個當量）和 0.3 M（DIC，6 個當量），持續(xù) 2 x 15 分鐘。在 HCTU/NMM 反應體系中，使用 0.3 M 氨基酸（6 當量）、0.3 M HCTU（6 當量）和 0.6 M NMM（12 當量）反應 2 x 1 分鐘。

Fmoc脫保護使用20% PIP在室溫或感應加熱到50°C下進行2 x 2分鐘。無論使用哪種合成溶劑，用TFA:TIS：水（95:2.5:2.5）在室溫下從樹脂中切割肽2小時，然后在冷 Et₂O 中沉淀，離心并傾倒Et₂O。

分析
使用配備 SPD-M20A 檢測器的 Shimadzu LCMS-2020 分析粗肽，色譜柱為 ACE Excel 3 C18-PFP，100 x 3.0 mm。流動相為水（A）和含 0.1% 反式脂肪酸的 MeCN（B）混合物。將 ACP 和 G-LHRH 溶于水/乙腈（1:1）中，在 5 分鐘內以 5 70% B 的梯度進行分析。PolyAla 肽溶解在純水中，用 0-60%B 的梯度在 9 分鐘內進行分析，流速均為 1 mL/min。

結果和討論
我們的研究重點是三種肽，它們在合成方面存在獨特的挑戰(zhàn)。第一種是ACP，一種活性酰基載體蛋白片段，由于在合成過程中容易形成內部二級結構，因此被公認為SPPS的評判標準。^6,7 第二種肽是Poly Ala，以其自組裝特性而聞名。最后，我們研究了G-LHRH，這是一種因其與促黃體生成激素釋放激素（LHRH）的關系而備受關注的多肽。⁷

這些肽的選擇有利于使用不同的合成溶劑對SPPS中的各種肽的合成過程進行全面研究。在改變溶劑系統(tǒng)和溫度之后，我們還測試了兩種不同的耦合條件：基于碳二亞胺的金標準耦合系統(tǒng)——DIC/Oxyma與安全高效的試劑—— HCTU/NMM。^8,9

與微波輔助多肽合成不同，Chorus多肽合成儀允許在 SPPS 合成過程中靈活使用各種二元溶劑系統(tǒng)。如表2所示，在DMSO/EtOAc 溶液中，所有三種肽的合成都在恒溫條件下順利進行，得到的粗肽純度從68.8%到85.4%不等。在 50°C 進行合成時，平均粗純度從77.9% 提高到82.4%。

圖1顯示了在 DMF 和 DMSO/EtOAc 中分別獲得的粗肽紫外色譜圖，證明這兩種溶劑系統(tǒng)之間具有良好的轉移性。
 

注：眾所周知，二甲基亞砜（DMSO）會在 SPPS 過程中導致蛋氨酸殘基氧化。然而，我們在氮氣環(huán)境下使用 DMSO/EtOAc 混合物成功合成了淀粉樣β肽，分析方法證實沒有發(fā)生任何蛋氨酸氧化（數據未顯示）。

PurePep Chorus多肽合成儀的適用性
溶液校準
PurePep Chorus 多肽合成儀（圖2）是一種功能強大的固相肽合成（SPPS）設備，可以輕松處理高粘度溶劑和溶劑混合物。該系統(tǒng)的溶劑校準選項可確保精確的溶劑輸送，而不論其粘度或成分如何，這對SPPS的成功至關重要。比較所有三種溶劑中的SPPS，DMSO/EtOAc 在恒溫條件下的粗純度優(yōu)于NBP和DMF。

感應加熱
PurePep Chorus 多肽合成儀利用精確的感應加熱和振蕩功能，在不過熱的情況下迅速達到所需的溫度。利用這一特點，可以在50℃溫度下使用DMSO/EtOAc低沸點二元混合物作為溶劑，進行高效的固相多肽合成 (SPPS)。提高溫度可使三種溶劑的平均純度更高。