多功能酶標(biāo)儀在微生物生長測定原理前景解析的應(yīng)用

600nm波長處的光密度（OD₆₀₀）可反映細(xì)菌和酵母等微生物的生長信息。更具體地說，反映種群中微生物數(shù)量隨時(shí)間的變化情況。

微生物生生長曲線

監(jiān)測微生物種群隨時(shí)間的變化，可繪制出一條生長曲線（圖1），分為四個(gè)生長階段：

 

遲緩期

Lag phase

少量微生物被置入培養(yǎng)基（接種）開始培養(yǎng)后，需要一段時(shí)間適應(yīng)新環(huán)境。在此期間不會發(fā)生分裂，種群密度保持不變。

對數(shù)期

Log phase

當(dāng)微生物適應(yīng)了新的環(huán)境，就會開始增殖。細(xì)胞數(shù)量在一段時(shí)間內(nèi)以幾何級數(shù)增加。對數(shù)期是微生物分裂最活躍的時(shí)期，可用于進(jìn)一步計(jì)算倍增時(shí)間和生長速率等參數(shù)。

穩(wěn)定期

Stationary phase

微生物的増殖受到培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的限制。一旦碳源或其他必需成分消耗殆盡，就會停止分裂。微生物生長曲線在這一階段的特點(diǎn)表現(xiàn)為微生物種群密度穩(wěn)定保持在較高水平。

衰亡期

 Death phase

隨著營養(yǎng)物質(zhì)、鹽、氨基酸的耗盡，以及酸或乙醇等有害廢物的積累，微生物培養(yǎng)環(huán)境條件惡化，微生物種群開始衰亡。這表現(xiàn)為微生物密度整體呈下降趨勢。

圖1：微生物生長曲線。分批培養(yǎng)中微生物數(shù)量的典型變化過程。

 

利用OD₆₀₀測量微生物生長的原理

OD₆₀₀基于吸收光檢測，測量的是穿過樣品，即微生物懸液的光。透射光與微生物的生長有什么關(guān)系？由于溶液中的微粒會產(chǎn)生散射光，微粒（微生物）越多，散射的光就越多。因此，隨著細(xì)菌或酵母數(shù)量成倍增長，光散射程度和測量的吸光度值會變大。同時(shí)，這意味著只是通過吸收光模式測定光散射的程度，而不是衡量分子對光的選擇性吸收。這一點(diǎn)至關(guān)重要：OD₆₀₀實(shí)際上測量的是散射引起的透射光損失，而不是吸光度！

 

多種生物和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域都要用到有關(guān)微生物生長的信息：

 抗生素耐藥性 

感染多重耐藥病原體的人數(shù)和因感染而死亡的人數(shù)不斷增加。亟需開發(fā)新型藥物或方法，來控制這些病原體。在新抗菌藥物的研發(fā)過程中，要用到OD₆₀₀評估其對微生物生長的抑制作用，以確定藥物的有效性。

 微生物生產(chǎn) 

微生物本身可以成為工業(yè)產(chǎn)品，可用于生產(chǎn)烘焙食品或奶酪等，還可用于生產(chǎn)酶、抗生素、維生素等產(chǎn)品。對于這兩種用途，都需要在過程初始對生長特性等方面進(jìn)行菌種優(yōu)化。生產(chǎn)過程一經(jīng)建立，就需要進(jìn)行微生物監(jiān)測。同樣，要用到OD₆₀₀監(jiān)測過程中的微生物生長情況。

 合成生物學(xué) 

使用基因工程經(jīng)典方法來構(gòu)建具有預(yù)定特性的生物系統(tǒng)。這意味著要對生物 “機(jī)器”進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，包括對基因進(jìn)行高度改造，甚至是改造成完全人工基因組。其目的是生產(chǎn)出石化產(chǎn)品替代品，如生物燃料或塑料，以及能感知污染物或降解塑料的微生物產(chǎn)品。常用的微生物有大腸桿菌（E. coli）和釀酒酵母菌（S. Cerevisiae）等，需要通過OD₆₀₀監(jiān)測其生長情況。

用OD₆₀₀檢測微生物生長的注意事項(xiàng)

如前所述，OD₆₀₀測量的是散射光，而非吸收光。理論上，描述吸光度與吸收分子濃度線性關(guān)系的朗伯-比爾定律不適用于OD₆₀₀測量。但實(shí)踐證明，盡管不使用吸光度，比爾-朗伯定律仍適用于低密度培養(yǎng)物。換句話說，OD₆₀₀值可以直接與極低密度懸液中的微生物數(shù)量相關(guān)。對于密度較高的培養(yǎng)物，OD₆₀₀的測量結(jié)果呈拋物線狀。只有將OD₆₀₀值與一系列微生物數(shù)量進(jìn)行校準(zhǔn)后，才能計(jì)算出這種培養(yǎng)物中的微生物數(shù)量。

選擇比色皿還是微孔板？

如果要對大容量的樣品進(jìn)行過程監(jiān)測，推薦使用比色皿。每隔一定時(shí)間（如1小時(shí)）取樣一次，測定微生物的種群密度。每次檢測需要約1.5ml微生物懸液，并且需要留出一定時(shí)間進(jìn)行樣品抽取（圖2）。

圖2：從酵母發(fā)酵罐中取樣。

 

微孔板則用于微生物生長的持續(xù)監(jiān)測。只需200µl懸液，以設(shè)定的時(shí)間間隔自動檢測生長過程。通常使用的是96孔板 ，非常適合多種樣品的重復(fù)測量，以及比較不同的培養(yǎng)基條件或菌株。對于中高通量應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)流程自動化。

 

如何選擇檢測儀器？

以吸收光模式測定顆粒的光散射時(shí)，使用不同的儀器得出的結(jié)果可能會有所差異。原因在于光束的類型不同，探測器與樣品的距離也不同。可以想象，當(dāng)通過微生物的光束發(fā)生散射，距離較近的探測器更容易捕捉到光線，而距離較遠(yuǎn)的探測器則有可能捕捉不到（圖3）。因此，建議使用可用OD₆₀₀來檢測微生物生長過程的一系列專用儀器。

圖3：不同的檢測儀器會產(chǎn)生不同的結(jié)果。該圖展示探測器位置的影響：在尺寸相同的情況下，距離樣品較近的探測器可檢測到散射光，而距離樣品較遠(yuǎn)的探測器則檢測不到光信號。

 

顯然，比色皿或微孔板的使用限制了選擇范圍，二者分別對應(yīng)分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀。但像SPECTROstar® Nano這種兼具比色皿和微孔板檢測能力的儀器，可以滿足您當(dāng)下和未來的所有需求（圖4）。

圖4：BMG LABTECH的SPECTROstar® Nano是一款帶有比色皿端口的酶標(biāo)儀。

 

 什么情況下需要校準(zhǔn)？

如果需要用OD₆₀₀值來確定溶液中的微生物數(shù)量/濃度（如每毫升的微生物數(shù)量），或者需要對OD₆₀₀散射測量的非線性性質(zhì)進(jìn)行校正，需要進(jìn)行校準(zhǔn)。為了進(jìn)行測量，需要制備已知微生物濃度的微生物懸浮液，并使用與后續(xù)實(shí)驗(yàn)相同的樣品量在所選儀器上測量OD₆₀₀。用測量值生成校準(zhǔn)曲線，隨后可將未知樣品的OD₆₀₀值與該曲線相關(guān)聯(lián)，并反算出濃度。由于光散射會隨著顆粒大小和形狀的變化而變化，因此對每種微生物都要進(jìn)行校準(zhǔn)。同樣，在更換分析儀器或樣品量時(shí)也需要進(jìn)行校準(zhǔn)。

OD600測量的前景

利用微孔板測量OD₆₀₀的方法越來越多地與發(fā)光或熒光等檢測模式相結(jié)合。微生物生長測量值可用于其他檢測法的歸一化處理。例如在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）期刊發(fā)表的一篇文章中，一項(xiàng)研究使用 CLARIOstar® 多功能酶標(biāo)儀測量金/黃/色/葡/萄/球/菌（Staphylococcus aureus）的翻譯。使用熒光模式測量了β-半乳糖苷酶報(bào)告基因，并將表示酶活性的信號歸一化為OD₆₀₀。另一個(gè)例子是使用化學(xué)發(fā)光法檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）基因表達(dá)，并將其歸一化為OD₆₀₀值。

檢測微生物生長的其他方法

散射比濁法

利用散射比濁法檢測微生物生長也是基于光散射原理。與測量散射導(dǎo)致的透射損失的OD₆₀₀值不同，散射比濁法直接檢測散射光。這是BMG LABTECH的NEPHELOstar® Plus（圖5）的強(qiáng)項(xiàng)。與基于吸光度模式的方法相比，散射比濁法的靈敏度更高，可檢測顆粒數(shù)量較低的樣品，因此適用于檢測微生物數(shù)量極少的懸液。

圖5：BMG LABTECH的NEPHELOstar® Plus是微孔板散射濁度儀，適用于檢測微生物數(shù)量極少的懸液。

 

穩(wěn)定熒光團(tuán)表達(dá)

由相關(guān)微生物穩(wěn)定表達(dá)的熒光團(tuán)（如GFP或RFP）也能夠反映微生物的生長情況。熒光強(qiáng)度與熒光團(tuán)濃度呈線性關(guān)系�？赏ㄟ^VANTAstar® 等熒光酶標(biāo)儀對熒光信號的變化進(jìn)行檢測（圖6）。

圖6：BMG LABTECH的VANTAstar®屬于多功能酶標(biāo)儀，可用于熒光檢測。

 

使用BMG LABTECH酶標(biāo)儀進(jìn)行微生物研究

酶標(biāo)儀為微生物生長檢測提供了更多可能性。如果您想進(jìn)一步了解BMG LABTECH為微生物研究制定的解決方案，請通過文末的“閱讀原文”閱讀或下載我們的微生物檢測手冊。



 

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