DAP-seq與RNA-seq聯(lián)合分析助力揭示AvERF73參與調(diào)控獼猴桃的耐澇性

澇害（Waterlogging）是長期陰雨或暴雨后，由于地表積水，地面徑流不能及時排除，積水深度過大，時間過長，造成作物根部氧氣不足，并產(chǎn)生乙醇等有毒有害物質(zhì)，從而影響作物生長，甚至造成作物死亡，造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的災害。
獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）也稱奇異果，原產(chǎn)于中國。獼猴桃因其獨特的風味，富含維生素C，被譽為水果之王。目前已經(jīng)躋身于世界主流消費水果之列。獼猴桃可以預防老年骨質(zhì)疏松，抑制膽固醇的沉積，防治動脈硬化，改善心肌功能，防治心臟病，也能對抗癌起作用。
2024年2月2日，中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所果樹生長發(fā)育與質(zhì)量控制重點實驗室的研究成果，發(fā)表在Horticultural Plant Journal期刊上（IF=5.7），文章題目為“AvERF73 positively regulates waterlogging tolerance in kiwifruit by participating in hypoxia response and mevalonate pathway” 。該研究使用DNA親和測序（DAP-seq）技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)揭示了AvERF73通過參與低氧應答和甲羥戊酸途徑，正調(diào)控獼猴桃的耐澇性。

作者在A. valvata KR5中鑒定出一個受洪澇誘導的ERF-VII基因，命名為AvERF73。隨后，作者檢測了AvERF73在不同組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在根系中的含量最高。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，AvERF73與AcERF74的蛋白序列最接近。蛋白序列分析顯示，AvERF73含有一個AP2保守結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域含有Ala14和Asp19保守位點，說明AvERF73屬于ERF轉(zhuǎn)錄家族。之后作者將AvERF73與GFP融合表達，并在細胞核中檢測到GFP熒光，證明AvERF73定位于細胞核中。

為研究AvERF73基因的功能，作者在擬南芥中過表達AvERF73基因，進行澇脅迫，發(fā)現(xiàn)過表達植株比WT植株更耐澇害，證實了AvERF73的過表達增強了擬南芥的耐澇害能力。

為進一步證實AvERF73在獼猴桃中的作用，作者利用“紅陽”獼猴桃葉條外植體轉(zhuǎn)化獲得了兩個過表達的獼猴桃品系OE53和OE65。澇脅迫后， 與過表達品系相比，WT植株出現(xiàn)了明顯的葉片枯萎癥狀，葉綠素水平降低，根部H₂O₂和MDA含量升高，而過表達品系生長良好。表明AvERF73在應對澇脅迫方面發(fā)揮著有益的作用。

為了更好地探究AvERF73在澇脅迫下的分子機制，作者對OE53和WT植株進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）。qRT-PCR檢測和相關性分析均表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準確可靠。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在澇脅迫下，與WT植株相比，OE53植株的上調(diào)基因在“cellular response to hypoxia”途徑顯著富集，這些低氧應答基因（HRGs )包含很多轉(zhuǎn)錄因子，例如LOB，WRKY，鋅指蛋白和NAC。，此外，上調(diào)基因在萜類化合物和甾醇生物合成過程也顯著富集，并且編碼MVA途徑關鍵酶的基因表達上調(diào)。由此推測AvERF73可能調(diào)控HRGs的表達，同時激活MVA通路積累萜類化合物和甾醇來應對澇脅迫。

 

為了鑒定AvERF73調(diào)控的靶基因，作者以OE53和WT植物的根部為材料進行了DAP-seq。兩次重復共鑒定到3744個基因，同時鑒定到AvERF73結(jié)合的GCC-box (‘GCCGCC’) motif。隨后作者將DAP-seq與RNA-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，找到了16個上調(diào)的AvERF73 可能直接靶向基因（DTGs）并進行重點關注。

為了進一步揭示AvERF73的潛在DTG。Venn圖分析發(fā)現(xiàn)，在"cellular response to hypoxia"和MVA途徑中，AcNAC022和AcHMGS1基因為AvERF73的潛在DTGs。Dual-Luc實驗發(fā)現(xiàn)AcNAC022和AcHMGS1與AvERF73蛋白呈正相關關系。據(jù)此推測，AvERF73調(diào)控了AcNAC022和AcHMGS1的表達。

結(jié)果表明，AvERF73是獼猴桃耐澇性的重要調(diào)節(jié)因子。一方面，過表達AvERF73可以激活AcNAC022的表達，以應對澇脅迫引起的缺氧。另一方面，過表達AvERF73可能通過直接激活AcHMGS1表達來調(diào)節(jié)合成萜類化合物和甾醇的MVA途徑。然而，AvERF73與AcNAC022和AcHMGS1的相互作用調(diào)控獼猴桃耐澇能力的機制有待進一步探索。本研究結(jié)果為研究獼猴桃耐澇調(diào)控網(wǎng)絡提供了候選基因和新思路。