常見磁珠選擇及其包被過程的注意事項
根據官能團的不同，磁珠類型自然非常的多樣，羧基磁珠、甲丙酰胺基磁珠、鏈霉親和素磁珠，其中常用的像酶促化學發(fā)光就用到的羧基磁珠比較多，而像羅氏電化學發(fā)光用的鏈霉親和素磁珠更多。鏈霉親和素磁珠通常是以三組分的形式，生物素標記抗體、磁珠、發(fā)光物標記抗體構成試劑盒，相比于其他類型反應更緩和。磁珠的直徑是非常重要的參數，磁珠直徑越小能夠結合的抗體越多，很好地增大抗體結合的表面積。提高抗原抗體結合效率。
1、羧基磁珠
表面羧基化大概是最常見的納米材料表面修飾方法了。通過在磁珠表面修飾羧基，能夠增加磁珠表面的親水性，提高磁珠在水溶液中的穩(wěn)定性，同時還能夠有效降低磁珠表面的非特異性吸附。羧基表面修飾工藝較為簡單，而且應用廣泛，幾乎每個磁珠廠家都會推出羧基表面修飾的磁珠。羧基磁珠表面修飾有豐富的羧基基團，能夠在特殊化學試劑的作用下將蛋白質、核酸、多肽等偶聯到磁珠表面，在蛋白純化、免疫檢測、分子檢測、NGS、細胞分離等領域應用廣泛。
在化學發(fā)光免疫分析中磁珠作為反應載體，其上包被特異性抗原或抗體，捕獲待測物中的靶標分子。蛋白質可以通過吸附作用與羧基修飾顆粒結合，吸附是由蛋白質和顆粒表面之間的疏水和離子相互作用介導的，吸附作用發(fā)生非常迅速。除了被吸附外，蛋白質還可以共價連接到羧基修飾的顆粒表面。羧基可以被水溶性碳二亞胺激活，與被吸附蛋白質的自由氨基反應形成酰胺鍵。此處講到的主要有疏水作用力和共價連接。在羧基磁珠包被過程中常用的緩沖體系是Tris體系。
羧基磁珠包被抗體蛋白的方法一般是通過EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）活化法。EDC是一種水溶性的小分子，無需有機溶劑助溶，同時反應過程中的異脲副產物也是水溶性的，通過水洗或透析就可以方便的去除。通過EDC活化后的羧基可以和抗體的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而將抗體固定在磁珠表面，這種反應通常在偏酸性環(huán)境下完成。
EDC活化羧基偶聯蛋白的方法有兩種，一種是一步法，先后將抗體、EDC加入至羧基磁珠溶液中，EDC邊活化羧基，同時與抗體氨基反應。這種反應簡單便捷可控，但是EDC過量容易導致抗體聚集體的發(fā)生，影響活性，并且EDC活化羧基后的活化酯中間體與氨基反應的速度較慢，且極易水解，因此反應效率往往較低。
另一種是采用兩步法，將EDC活化羧基的反應，以及與蛋白氨基形成酰胺鍵的反應分為兩個步驟。這種方法通常需要在第一步活化羧基過程中引入Sulfo-NHS活化酯。Sulfo-NHS（N-羥基琥珀酰亞胺酯）是一種能夠快速和氨基反應的親水小分子。EDC活化羧基后，與Sulfo-NHS形成穩(wěn)定的中間體，去除掉多余的EDC后，再加入抗體蛋白，蛋白上的氨基再與NHS中間體反應形成酰胺鍵。采用兩步法能夠有效避免EDC殘留導致抗體蛋白的聚集，同時Sulfo-NHS的引入能夠有效提高酰胺鍵形成的效率，有的研究表明，引入Sulfo-NHS的兩步偶聯法，蛋白偶聯效率是單獨采用EDC的20倍。此外，Sulfo-NHS的磺酸基能夠在羧基活化后，能夠在微球表面形成負電荷層，維持微球表面的穩(wěn)定性，防止磁珠聚集。
2、Tosyl甲苯磺�；胖�
甲苯磺�；腔瘜W發(fā)光免疫檢測當中應用最為廣泛的一種磁珠表面。甲苯磺�；恍枰罨瘎╊A先活化，在特定的溶液中就能夠與抗體產生共價結合。反應可控性強，非特異性吸附低，包被過程的重現性好，因此在批量制備磁珠的時候，批間控制更好。
市場上生產甲苯磺�；钠放茝S家主要有Dynabeads，以及JSR，Merck也推出了甲苯磺�；揎椀拇胖�。由于甲苯磺�；谋砻嫘揎椆に嚫鼮閺碗s，因此鮮有國內磁珠廠家優(yōu)先開發(fā)這類磁珠。
因涂層中含有甲苯磺�；詿o需羧合劑，含有氨基的抗體等分子以化學結合的方式固定在磁珠表面。隨著化學結合的進行，甲苯磺�；鶗饾u脫離，粒子表面親水性增強，從而維持磁珠表面偶聯物生物活性，并可有效抑制分析時的非特異性反應。
在pH為7.0至8.0的緩沖體系內，甲苯磺�；c蛋白上的巰基反應。當反應緩沖pH調節(jié)至8.5至9.5時，與蛋白上的氨基反應。
一般偶聯抗體過程中，采用100mM的硼酸緩沖液作為偶聯過程中的反應溶液。先將磁珠用硼酸緩沖液清洗兩到三次，最后用超聲充分將磁珠分散重懸，加入抗體蛋白。通常，甲苯磺�；陌贿^程中的濃度較羧基的高，一般采用30mg/mL的磁珠濃度進行偶聯包被。磁珠蛋白混勻后，將反應管放在設置好的37°C恒溫搖床中過夜反應（12-18小時），抗體與甲苯磺酰基即可完成反應。如果降低反應穩(wěn)定，反應時間則需要進一步延長。此后，即可用含有0.5%BSA，pH7.4的PB緩沖液對磁珠進行封閉。在37°C條件下，只需要封閉1小時即可，也可在4°C條件下過夜反應。包被過程結束后，可以采用工作緩沖液作為磁珠的保存液，通常保存濃度為10mg/mL。
3、鏈霉親和素磁珠
鏈霉親和素是一種四聚體糖蛋白，每一個亞基可以結合一個生物素小分子。二者之間的結合是已知的最強非共價結合之一。一般的，可以采用共價偶聯的方式，將鏈霉親和素包被在磁珠表面，再將抗體蛋白生物素化，通過生物素-鏈霉親和素之間的特異性結合，將抗體連接至磁珠表面。這種方式免疫檢測磁珠具有一定通用性，只用一款磁珠，即可完成所有檢測。羅氏診斷幾乎所有化學發(fā)光項目都采用生物素-鏈霉親和素的方式完成檢測。
鏈酶親和素磁性微球可以輕松和生物素化的生物大分子結合，實現探針的制備，或者生物大分子的分離。鏈酶親和素磁珠偶聯C反應蛋白(CRP)單克隆抗體并用于免疫層析試紙條。磁珠偶聯鏈霉親和素能從樣品中對生物素標記的分子進行高純度的特異性吸收。因磁珠表面親水性聚合物涂層不會影響酶促反應進行，在PCR反應體系中混入磁珠也不會對核酸擴增產生影響。在酶免測定中，還可作為生物素標記抗體的載體進行使用。
4、包被經驗
常用的磁珠包被抗體比例是20μg/mg，磁珠母液濃度是10mg/mL，通常稀釋的工作液是中性緩沖液，1:50稀釋，工作液終濃度0.2mg/mL，磁珠包被過程中可能會出現聚集現象。此時就要考慮磁珠與抗體處理工藝，或者抗體本身原料存在問題，大部分項目是不會有聚集，而磁珠包被抗原的項目會出現聚集項目。此時就要篩選緩沖體系，或者對原料進行純化處理，像透析等。
上海領駿生物科技有限公司成立于2016年，位于上海市青浦區(qū)張江云立方園區(qū)。公司長期致力于生物領域內相關產品的研發(fā)、生產和銷售，產品主要包括磁性納米材料和磁珠法核酸提取純化試劑。公司一直堅持以“質量、誠信、團結、奮進”為宗旨，嚴格規(guī)范質量管理體系，持續(xù)創(chuàng)新、精益求精，為客戶提供優(yōu)質的產品和服務,被認定為國家級高新技術企業(yè)和上海市專精特新企業(yè)。
表面羧基化大概是最常見的納米材料表面修飾方法了。通過在磁珠表面修飾羧基，能夠增加磁珠表面的親水性，提高磁珠在水溶液中的穩(wěn)定性，同時還能夠有效降低磁珠表面的非特異性吸附。羧基表面修飾工藝較為簡單，而且應用廣泛，幾乎每個磁珠廠家都會推出羧基表面修飾的磁珠。羧基磁珠表面修飾有豐富的羧基基團，能夠在特殊化學試劑的作用下將蛋白質、核酸、多肽等偶聯到磁珠表面，在蛋白純化、免疫檢測、分子檢測、NGS、細胞分離等領域應用廣泛。
在化學發(fā)光免疫分析中磁珠作為反應載體，其上包被特異性抗原或抗體，捕獲待測物中的靶標分子。蛋白質可以通過吸附作用與羧基修飾顆粒結合，吸附是由蛋白質和顆粒表面之間的疏水和離子相互作用介導的，吸附作用發(fā)生非常迅速。除了被吸附外，蛋白質還可以共價連接到羧基修飾的顆粒表面。羧基可以被水溶性碳二亞胺激活，與被吸附蛋白質的自由氨基反應形成酰胺鍵。此處講到的主要有疏水作用力和共價連接。在羧基磁珠包被過程中常用的緩沖體系是Tris體系。
羧基磁珠包被抗體蛋白的方法一般是通過EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）活化法。EDC是一種水溶性的小分子，無需有機溶劑助溶，同時反應過程中的異脲副產物也是水溶性的，通過水洗或透析就可以方便的去除。通過EDC活化后的羧基可以和抗體的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而將抗體固定在磁珠表面，這種反應通常在偏酸性環(huán)境下完成。
EDC活化羧基偶聯蛋白的方法有兩種，一種是一步法，先后將抗體、EDC加入至羧基磁珠溶液中，EDC邊活化羧基，同時與抗體氨基反應。這種反應簡單便捷可控，但是EDC過量容易導致抗體聚集體的發(fā)生，影響活性，并且EDC活化羧基后的活化酯中間體與氨基反應的速度較慢，且極易水解，因此反應效率往往較低。
另一種是采用兩步法，將EDC活化羧基的反應，以及與蛋白氨基形成酰胺鍵的反應分為兩個步驟。這種方法通常需要在第一步活化羧基過程中引入Sulfo-NHS活化酯。Sulfo-NHS（N-羥基琥珀酰亞胺酯）是一種能夠快速和氨基反應的親水小分子。EDC活化羧基后，與Sulfo-NHS形成穩(wěn)定的中間體，去除掉多余的EDC后，再加入抗體蛋白，蛋白上的氨基再與NHS中間體反應形成酰胺鍵。采用兩步法能夠有效避免EDC殘留導致抗體蛋白的聚集，同時Sulfo-NHS的引入能夠有效提高酰胺鍵形成的效率，有的研究表明，引入Sulfo-NHS的兩步偶聯法，蛋白偶聯效率是單獨采用EDC的20倍。此外，Sulfo-NHS的磺酸基能夠在羧基活化后，能夠在微球表面形成負電荷層，維持微球表面的穩(wěn)定性，防止磁珠聚集。
2、Tosyl甲苯磺�；胖�
甲苯磺�；腔瘜W發(fā)光免疫檢測當中應用最為廣泛的一種磁珠表面。甲苯磺�；恍枰罨瘎╊A先活化，在特定的溶液中就能夠與抗體產生共價結合。反應可控性強，非特異性吸附低，包被過程的重現性好，因此在批量制備磁珠的時候，批間控制更好。
市場上生產甲苯磺�；钠放茝S家主要有Dynabeads，以及JSR，Merck也推出了甲苯磺�；揎椀拇胖�。由于甲苯磺�；谋砻嫘揎椆に嚫鼮閺碗s，因此鮮有國內磁珠廠家優(yōu)先開發(fā)這類磁珠。
因涂層中含有甲苯磺�；詿o需羧合劑，含有氨基的抗體等分子以化學結合的方式固定在磁珠表面。隨著化學結合的進行，甲苯磺�；鶗饾u脫離，粒子表面親水性增強，從而維持磁珠表面偶聯物生物活性，并可有效抑制分析時的非特異性反應。
在pH為7.0至8.0的緩沖體系內，甲苯磺�；c蛋白上的巰基反應。當反應緩沖pH調節(jié)至8.5至9.5時，與蛋白上的氨基反應。
一般偶聯抗體過程中，采用100mM的硼酸緩沖液作為偶聯過程中的反應溶液。先將磁珠用硼酸緩沖液清洗兩到三次，最后用超聲充分將磁珠分散重懸，加入抗體蛋白。通常，甲苯磺�；陌贿^程中的濃度較羧基的高，一般采用30mg/mL的磁珠濃度進行偶聯包被。磁珠蛋白混勻后，將反應管放在設置好的37°C恒溫搖床中過夜反應（12-18小時），抗體與甲苯磺酰基即可完成反應。如果降低反應穩(wěn)定，反應時間則需要進一步延長。此后，即可用含有0.5%BSA，pH7.4的PB緩沖液對磁珠進行封閉。在37°C條件下，只需要封閉1小時即可，也可在4°C條件下過夜反應。包被過程結束后，可以采用工作緩沖液作為磁珠的保存液，通常保存濃度為10mg/mL。
3、鏈霉親和素磁珠
鏈霉親和素是一種四聚體糖蛋白，每一個亞基可以結合一個生物素小分子。二者之間的結合是已知的最強非共價結合之一。一般的，可以采用共價偶聯的方式，將鏈霉親和素包被在磁珠表面，再將抗體蛋白生物素化，通過生物素-鏈霉親和素之間的特異性結合，將抗體連接至磁珠表面。這種方式免疫檢測磁珠具有一定通用性，只用一款磁珠，即可完成所有檢測。羅氏診斷幾乎所有化學發(fā)光項目都采用生物素-鏈霉親和素的方式完成檢測。
鏈酶親和素磁性微球可以輕松和生物素化的生物大分子結合，實現探針的制備，或者生物大分子的分離。鏈酶親和素磁珠偶聯C反應蛋白(CRP)單克隆抗體并用于免疫層析試紙條。磁珠偶聯鏈霉親和素能從樣品中對生物素標記的分子進行高純度的特異性吸收。因磁珠表面親水性聚合物涂層不會影響酶促反應進行，在PCR反應體系中混入磁珠也不會對核酸擴增產生影響。在酶免測定中，還可作為生物素標記抗體的載體進行使用。
4、包被經驗
常用的磁珠包被抗體比例是20μg/mg，磁珠母液濃度是10mg/mL，通常稀釋的工作液是中性緩沖液，1:50稀釋，工作液終濃度0.2mg/mL，磁珠包被過程中可能會出現聚集現象。此時就要考慮磁珠與抗體處理工藝，或者抗體本身原料存在問題，大部分項目是不會有聚集，而磁珠包被抗原的項目會出現聚集項目。此時就要篩選緩沖體系，或者對原料進行純化處理，像透析等。
上海領駿生物科技有限公司成立于2016年，位于上海市青浦區(qū)張江云立方園區(qū)。公司長期致力于生物領域內相關產品的研發(fā)、生產和銷售，產品主要包括磁性納米材料和磁珠法核酸提取純化試劑。公司一直堅持以“質量、誠信、團結、奮進”為宗旨，嚴格規(guī)范質量管理體系，持續(xù)創(chuàng)新、精益求精，為客戶提供優(yōu)質的產品和服務,被認定為國家級高新技術企業(yè)和上海市專精特新企業(yè)。
