微孔板檢測(cè)在微生物研究中的應(yīng)用

酶標(biāo)儀為涉及細(xì)菌、真菌和病毒的實(shí)驗(yàn)提供了理想的檢測(cè)平臺(tái)。本文將探討酶標(biāo)儀在微生物研究中的優(yōu)勢(shì)，及其在生長(zhǎng)和活力測(cè)定、功能測(cè)定，以及藥物篩選中的作用。

 

利用酶標(biāo)儀提升微生物分析水平

 

生長(zhǎng)和活力測(cè)定

 

抗微生物篩選、生物量監(jiān)測(cè)和發(fā)酵等多種應(yīng)用都涉及監(jiān)測(cè)微生物種群隨時(shí)間的變化。評(píng)估懸液中微生物生長(zhǎng)情況，通常是通過測(cè)量濁度或600nm波長(zhǎng)處溶液的光密度（OD600）。OD600測(cè)量的是散射導(dǎo)致的光傳輸損失，這種損失會(huì)隨著溶液中微生物數(shù)量的增加而增加。傳統(tǒng)的OD600測(cè)量方法是使用比色皿和分光光度計(jì)。使用酶標(biāo)儀也可以準(zhǔn)確測(cè)量OD600，更可提高通量并大幅降低樣品使用量。若配備ACU（大氣控制單元），可實(shí)現(xiàn)氧氣和二氧化碳水平的獨(dú)立控制和溫度控制，有助于在最佳條件下進(jìn)行長(zhǎng)期的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究。

 

OD600：微生物生長(zhǎng)測(cè)定的原理、應(yīng)用和前景

 

為了在復(fù)雜的樣品中更好地識(shí)別微生物，還可以用熒光蛋白（如綠色熒光蛋白）對(duì)微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在這種情況下，微生物的生長(zhǎng)可以在多功能酶標(biāo)儀中進(jìn)行測(cè)量，結(jié)合 OD600和另外的檢測(cè)模式，如熒光強(qiáng)度或熒光偏振（圖1）。

圖1：B群無乳酸鏈球菌的吸光度（A）、熒光（B）和熒光偏振（C）曲線。

 

另一種測(cè)量懸液中微生物生長(zhǎng)的方法是散射比濁法。這種技術(shù)測(cè)量的是樣品中不溶性顆粒散射光的強(qiáng)度，尤其適用于測(cè)量具有非均質(zhì)生長(zhǎng)模式的微生物的生長(zhǎng)情況。在測(cè)量細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)時(shí)，基于微孔板的散射比濁測(cè)定可實(shí)現(xiàn)比傳統(tǒng)技術(shù)更高的可再現(xiàn)性和靈敏度。

 

藥物篩選

 

抗微生物藥物耐藥性已被世界衛(wèi)生組織列為全球十大公共衛(wèi)生威脅之一，開發(fā)預(yù)防和治療耐藥菌感染的有效工具越來越重要。噬菌體，這種只侵襲細(xì)菌細(xì)胞的病毒，成為一種潛在的抗生素替代品�；谖⒖装宓臋z測(cè)是確定噬菌體抗菌特性的理想平臺(tái)。除此之外，酶標(biāo)儀也可用于進(jìn)一步的抗菌研究，例如通過最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定，監(jiān)測(cè)特定微生物對(duì)藥物的敏感性或耐藥性。這種方法可用于識(shí)別微弱的劑量依賴效應(yīng)，而采用終點(diǎn)讀數(shù)或目測(cè)讀數(shù)可能會(huì)遺漏這些效應(yīng)（圖2）。

 

圖2：白色念珠菌在含兩性霉素B (AMB) 培養(yǎng)基中的劑量依賴性生長(zhǎng)曲線。

 

開發(fā)新型抗菌藥物的關(guān)鍵步驟是篩選大型化合物庫。高通量檢測(cè)對(duì)于高效、及時(shí)地決定哪些候選藥物需要進(jìn)一步測(cè)試至關(guān)重要。多功能酶標(biāo)儀支持研究人員在單個(gè)孔中使用不同的探測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，從而大幅減少藥物篩選所需的時(shí)間和成本。

 

除了新型候選藥物外，基于微孔板的高通量篩選還可用于將現(xiàn)有藥物重新用于新靶點(diǎn)，比如新出現(xiàn)的疾病。AlphaLISA等基于Alphascreen® 的檢測(cè)方法適合在高通量環(huán)境中研究藥物對(duì)蛋⽩質(zhì)的相互作⽤，從而對(duì)新型病原體做出快速反應(yīng)。

 

酶標(biāo)儀不僅可用于確定細(xì)菌或真菌微生物的新治療方案，還可以通過高通量熒光和/或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)評(píng)估宿主細(xì)胞的活力，以篩選新型抗病毒候選藥物。

 

功能測(cè)定

 

功能測(cè)定對(duì)于更好地了解引起微生物復(fù)制和感染的分子和細(xì)胞機(jī)制至關(guān)重要。例如，熒光偏振 RNA 合成測(cè)定可用于鑒定流感病毒等病毒的RNA聚合酶。還有一些檢測(cè)方法使用表達(dá)報(bào)告基因（如熒光蛋白）的轉(zhuǎn)基因病毒，這些報(bào)告基因只在病毒復(fù)制過程中表達(dá)。在這方面，配備ACU的酶標(biāo)儀可以實(shí)時(shí)連續(xù)測(cè)量基因表達(dá)長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)，適合從動(dòng)力學(xué)角度測(cè)試抗病毒藥物的效果（圖3）。

 

圖3：在 PPIA抑制劑存在的情況下檢測(cè)到的mCherry熒光信號(hào)。

 

酶標(biāo)儀也可用于研究酶活性和信號(hào)活性，甚至可以檢測(cè)群體感應(yīng)（QS），一種使細(xì)菌判斷和響應(yīng)環(huán)境條件的過程。由于QS會(huì)誘導(dǎo)某些細(xì)菌（如費(fèi)氏弧菌 Vibrio fischeri）發(fā)光，可使用多功能化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀同時(shí)測(cè)定環(huán)境條件和/或抑制劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)（吸光度）和QS（化學(xué)發(fā)光）的影響�；谖舛鹊臋z測(cè)方法也可用于評(píng)估微生物生存必需酶的活性。例如，使用可被這些必需酶裂解為發(fā)色團(tuán)的底物，可以實(shí)時(shí)反映微生物的生長(zhǎng)和存活情況。

 

結(jié)論

 

基于微孔板的檢測(cè)方法比傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法更具成本效益和時(shí)間效益，可用于研究各種微生物過程，并產(chǎn)生高度可靠、可再現(xiàn)性和準(zhǔn)確的結(jié)果。與環(huán)境控制、孵育和振蕩工具的集成，以及高通量能力，使酶標(biāo)儀成為篩選新型抗菌藥物和實(shí)時(shí)分析微生物生長(zhǎng)的理想平臺(tái)。

 

BMG LABTECH提供各種模塊化的單功能或多功能酶標(biāo)儀，涵蓋多種檢測(cè)模式，可滿足每個(gè)微生物實(shí)驗(yàn)室的需要。

 

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