三室脂質體融合:生物催化級聯(lián)的功能原始細胞和動態(tài)DNA機器的操作

1背景介紹 

細胞-細胞融合過程在神經(jīng)傳遞、外排與內吞、信號傳導與病毒感染等生物轉化中起著關鍵作用。開發(fā)自組織功能細胞樣的微/納米容器，即原細胞(Protocells)，是快速發(fā)展的“系統(tǒng)化學”領域的主要目標。不同的原始細胞內含物包括脂質體(liposomes)、聚合體(polymersomes)、樹突體(dendrosomes)、蛋白質體(proteinsomes)、水微滴(aqueousmicrodroplets)和水凝膠微膠囊(hydrogelmicrocapsules)。通過這些組件的整合，細胞樣環(huán)境中存在裝配催化、光催化、和生物催化等反應。細胞樣內含物的融合以及原始細胞內部與外部環(huán)境之間化學物質的交換產生了功能性微/納米儲庫，揭示了細胞內編程的催化功能或用于治療應用的功能性“智能”藥物載體。同時，細胞外囊泡及其在細胞間傳遞核酸和蛋白質的生理功能越來越多引起人們的研究興趣。特別是，研究集中于模擬天然系統(tǒng)的合成類似物的發(fā)展，并努力確定合成細胞外囊泡的臨床應用。

論文導讀

該研究報道了報告三種不同負載的脂質體逐步融合到集成的功能原始細胞模型系統(tǒng)。具體地說，研究者解決了逐步光和pH觸發(fā)的核酸修飾脂質體的融合，在其中加入了休眠的、非活性的負載。存在于分離的脂質體中的成分，在融合后產生相互通信成分的集成合成細胞集合，允許生物催化級聯(lián)操作和指示DNA類型的機械。該結果通過提供構建細胞樣功能容器的方法，推進了快速發(fā)展的“合成細胞”領域。除了模擬自然過程的重要意義之外，該研究還證明了生物催化級聯(lián)作為監(jiān)測脂質體融合的工具的成功應用，以及在受限環(huán)境中為DNA機器的動態(tài)調制而設計納米組件的手段。

三種核酸功能化脂質體以光和pH為觸發(fā)點的逐步融合原理，以及融合過程的物理、光譜和成像方法如圖1所示。

圖1. 以光和pH為觸發(fā)劑的三種脂質體(A)、(B)和(C)的逐步融合示意圖。

圖2. 磺胺若丹明B的時間熒光變化

圖2中的曲線(i)描述了脂質體(a)用(b)在pH = 5.0條件下，用(b)逐步照射(波長為365 nm)，然后用脂質體(c)處理光融合脂質體(pH = 5.0)后脂質體系統(tǒng)的熒光變化。脂質體(a)和(b)在波長為365 nm時輻照，熒光增強，在≈1000 s后趨于穩(wěn)定，這與脂質體的融合和熒光標記的稀釋一致。用脂質體(c)進一步處理融合脂質體，進一步增強了磺胺嘧啶B標記的時間依賴性熒光變化，也達到飽和水平。脂質體中熒光標記的進一步增加與三種脂質體融合容器中熒光標記的融合引導稀釋一致。值得注意的是，脂質體逐步融合后，對脂質體溶液進行色譜分離，探測其周圍體積溶液中是否存在磺胺丹B。洗脫液中檢測不到稀釋后的熒光染料的熒光信號，從而消除了融合過程中染料泄漏的可能。此外，需要注意的是，硫磺胺B在融合第二步的熒光變化明顯低于脂質體(a) + (B)的融合**步，這是由于熒光的非線性聚合染料稀釋后的變化。

此外，圖3展示稀釋后磺胺B的非線性熒光變化。利用(a) + (b)和(a) + (b) + (c)融合脂質體的逐步大小變化，通過動態(tài)光散射（DLS）評估，淬滅的熒光團標記沒有從脂質體中泄漏，可以估計融合后探針的稀釋系數(shù)，并進一步評估兩步融合過程中熒光變化的程度。通過這一過程，驗證了圖1曲線所示的淬滅熒光團探針的實驗熒光變化，每一步的融合效率≈80-85%。已知脂質體的初始濃度和三脂質體的總體融合效率≈80-85%，我們估計融合的三脂質體的濃度為≈2.7×10¹²脂質體/mL，該值與NanoCoulter粒度儀裝置評估的濃度一致（具體操作如下）。

脂質體的制備。將4 mM DOPC（二油酰基卵磷脂）、2 mM CHOL（膽固醇）加入10 mL圓底燒瓶中，溶于4 mL氯仿中。隨后，將原液在氯仿中用氮氣蒸發(fā)形成脂膜，并在旋轉蒸發(fā)器下進一步干燥。脂膜用20 mM PBS(pH 7.0)水合，*終脂質濃度為4 mM。隨后，使用注射器將混懸液重復通過包括0.22µm孔的濾膜（聚碳酸酯）21次，以形成脂質體混懸液。分別用60~200 nm或150~500 nm兩種測量范圍的金屬納米孔芯片在NanoCoulter（ResunTech, co., Shenzhen）納米庫爾特粒度儀上計算脂質體的平均粒徑與數(shù)量（濃度）。

為了進行比較，圖2A曲線(ii)描繪了在pH = 8.0下，脂質體(a)、(b)和(c)在不輻照的情況下逐步混合后的熒光變化。沒有觀察到熒光變化，這表明確實需要光誘導/ ph酸化脂質體的耦合動態(tài)融合來刺激脂質體混合物中的熒光變化。圖1B描述了脂質體組合的時間尺寸變化，在它們使用光/pH觸發(fā)融合時。單個脂質體(a)的平均尺寸為225±5 nm，而脂質體(a)和脂質體(b)的輻照量為365 nm，可使脂質體的平均尺寸擴大至240±5 nm。(a)/(b)融合脂質體與脂質體(c)在pH = 5.0條件下處理后，生成的脂質體結構尺寸為265±5 nm曲線(i)。與此同時，脂質體(a)與脂質體(b)依次處理，然后與脂質體(c)依次處理，在沒有各自的融合觸發(fā)器的情況下，導致脂質體的大小不變，曲線(ii)，225±5 nm，證實沒有發(fā)生融合。圖1C描繪了脂質體在不同融合步驟下的形態(tài)變化所對應的SEM圖像。脂質體(a)、(b)和(c)的混合物顯示出直徑約為200 nm的單個球形結構(圖2)。盡管如此，熒光研究(圖1A)和進一步的實驗證實了相互作用的脂質體之間的負載交換，以及脂質體在連續(xù)光/pH觸發(fā)下的支持大小和形狀變化，將為三種脂質體的融合提供令人信服的證據(jù)。

通過葡萄糖氧化酶(GOx)-辣根過氧化物酶(HRP)級聯(lián)在融合容器中成功運作，進一步證實了光/ ph誘導脂質體(a)、(b)和(c)的連續(xù)融合確實進行了，并導致了融合容器中負載的交換。研究者提供了通過脂質體-脂質體融合過程激活酶級聯(lián)的簡單模型，作為細胞-細胞融合引起的生物催化級聯(lián)的模型。此外，進一步的融合脂質體引導的DNA機制也展示了融合脂質體原始細胞中mRNA的轉錄（詳細內容可點擊閱讀原文下載獲�。�。

文中使用到的NanoCoulter—— 納米庫爾特粒度儀， 采用新一代庫爾特原理的電學檢測方法，粒徑分辨率可達到1 nm。依次檢測樣本中每一個顆粒，實現(xiàn)真正意義上的納米單顆粒檢測，數(shù)據(jù)精度媲美電鏡，一次測試可獲得多維度顆粒表征數(shù)據(jù)（粒徑、濃度、zeta電位、形態(tài)），為科學研究、生產品控、醫(yī)藥研發(fā)、疾病診斷等領域，提供精準支持；更加快速、**的助力病毒顆粒、脂質體、外泌體等細胞外囊泡、乳膠微球、納米磁珠、無機納米材料等的研究和表征質控。

脂質體應用案例