Biolog YT板的主要用途、使用流程及注意事項

主要用途
YT微孔板使用固定在微孔板上的94個不同的生化試驗來對廣泛的酵母菌提供表型概況并  進行鑒定。Biolog鑒定系統(tǒng)中的軟件（MicrologTM 3）通過讀取YT微孔板上所表現(xiàn)出的表型圖譜 來對細菌進行鑒定。
概述
1、Biolog YT微孔板通過微生物對微孔板中的不同碳源的利用及氧化情況進行測試，測試 使得有特征代謝的孔變成紫色，從而使微生物在測試板上顯示出“代謝指紋圖譜 ”1，2。 
2、所有必要的營養(yǎng)物質(zhì)以及生化試劑都被預先填充、干化在96個孔中。在一部分孔中  （A-C行），四唑類氧化還原染料通過色度的變化來指示碳源的氧化情況。而剩下的孔（D-H行）則通過濁度的變化來顯示微生物對碳源的利用情況。 
3、試驗的操作過程非常簡單。在平板上按照常規(guī)方法劃線分離需要鑒定的微生物，然后 將分離的到的純種用棉簽挑到無菌水中，配成指定細胞濃度的菌懸液。將菌懸液按每 孔100µl的量加到Y(jié)T板后孵育。所有的孔在剛開始的時候都是無色的，當孵育一段時 間之后，那些能被細胞利用的碳源孔中的呼吸作用增強了。增強的呼吸作用導致四唑 氧化還原染料被還原，變成紫色。同時，能被利用的碳源孔中的微生物也開始生長， 導致濁度變高。YT板的兩個陰性對照孔（A1和D1）中不含碳源。 
4、孵育后24，48或者72小時后，通過YT板上顯紫色及濁度變化所產(chǎn)生的指紋圖譜同   Biolog數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對。如果找到匹配的，所分離出來的微生物得到鑒定。

注意事項
       為獲取準確且可重復的結(jié)果，請務(wù)必遵循下列建議：
1、純培養(yǎng)是一切鑒定的前提，
2、使用專用培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)非常重要，同一菌株可能會由于接種前在不同的培養(yǎng)基上生 長而在鑒定時產(chǎn)生不同的代謝特征。
3、無菌操作，避免污染影響結(jié)果。
4、應盡量使用一次性玻璃器皿來處理所有細胞懸液和其他溶液。已經(jīng)清洗過的玻璃器皿可能 含有微量的皂劑或洗滌劑，會影響到結(jié)果。
5、在使用前將YT微孔板及無菌水接種液預熱到室溫。一些菌種對冷沖擊非常敏感。
6、準確校正濁度儀，使菌懸液濃度位于指定的濃度范圍。請參考“接種液制備”這一部分內(nèi) 容。
7、YT鑒定板上包被的化學物質(zhì)對溫度和光敏感。AN微孔板請置于2-8℃冰箱，避光保存。如 孔顏色為深褐色表示鑒定板碳源已變質(zhì)。一些孔本身就是黃色或淺紅色，這是正常的。
8、請永遠記�。耗阏�在測試的是活細胞的代謝特性。一些菌種在受到應激作用（如溫度、pH 及滲透壓變化）時會失去代謝活力，哪怕是僅僅幾分鐘。為了從這些微孔板上獲得可接受 的最佳效果，請意識到這些細胞是活的，并小心的對待它們。
9、檢查 YT 鑒定板：
      請勿使用過期的 YT 鑒定板。要將其帶著外包裝放于 2-8℃冰箱，避光保存。

試劑及耗材 plate streakers (10x100); Catalog No.3026 (50x20).
6、Transfer Pipets無菌一次性移液管: Catalog No.3019- Sterile disposable 9 inch transfer pipets.
7、Reservoirs無菌一次性V型加樣槽: Catalog No.3102- Sterile disposable reservoirs.
8、Multichannel Pipettes多道移液器: Catalog No.3711- 8 channel electronic pipettor.
9、Pipet Tips無菌移液器吸頭: Catalog No. 3201- Sterile racked pipet tips for Ovation multichannel pipettor; Catalog No. 3001- Matrix multichannel pipettor tips.
10、Turbidimeter濁度計: Catalog No.3531- 110 volt model, Catalog No.3532 -220 volt model, Catalog No.3585 - 240 volt model.
11、Turbidity Standards標準比濁管: YT (Biolog Catalog #3415).
12、Incubator 培養(yǎng)箱：26℃ .

操作規(guī)程
      做實驗前，先將YT鑒定板和接種液恢復至室溫25度。 3、接種時不要將培養(yǎng)基挑進接種液，先用棉棒蘸些接種液，蘸取菌后在接種液液體上面管壁上反復涂使其分散，然后利用接種液將其沖洗下制備成均一接種液。也可利用無菌吸管混 勻菌液，但應避免產(chǎn)生氣泡。如果還有未打散的菌塊，將接種液靜置幾分鐘，使之沉淀下去。
4、準確調(diào)整菌懸液的菌體濃度到47%T，上下偏差2%。如濃度太高可以加入一些新的接種液， 如濃度太低則繼續(xù)加入更多菌。
5、制備好菌懸液后，菌懸液倒入v型槽，然后迅速接到板上。接菌懸液的過程不超過20min（超 過20min，一些菌會因失去氮源喪失代謝活力）。
 
第四步：接種至鑒定板
1、迅速將配制好的菌懸液倒入V型槽中（不要將沉淀倒入），并用移液器將菌懸液接種至YT 板上（每孔100 μl）。
2、接種完后，蓋上微孔板蓋子。
 
第五步：培養(yǎng)鑒定板
1、將鑒定板置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、注意保持培養(yǎng)環(huán)境的濕度，以減少微孔板中菌液的蒸發(fā)�？梢允褂迷诳擅芊獾乃芰虾兄蟹�
置濕紙巾或砂布，再將微孔板放置其中的方法來保濕。
3、培養(yǎng)鑒定板24，48或者72h，直到微孔板圖譜形成。

結(jié)果
1、培養(yǎng)完畢后請使用MicrologTM 3軟件進行結(jié)果獲取，請參見軟件說明書。
2、A1孔作為A-C行的參照孔，D1孔作為D-H行的參照孔。以590nm波長分別測試A-C行的顏 色變化，以及D-H行的濁度變化。一般酵母菌鑒定板的圖譜很難用肉眼來判讀。
3、“假陽性”是指A1，D1 還有其他本該陰性的孔顯示陽性反應。（A1孔顯紫色，D1孔產(chǎn)生 濁度變化）�？赡艿脑�因包括細胞利用了自身的胞外多糖，儲存的內(nèi)源底物，或細胞裂解的 物質(zhì)。不正確使用鑒定板也可能產(chǎn)生假陽性，請參考“問題解答”部分。一些酵母菌利用 碳源生成帶有顏色的（如褐色）的副產(chǎn)物。這種情況應看作“陽性”反應。
4、對于YT鑒定板，培養(yǎng)24小時后，只有當相似度指數(shù)（Similarity Index）大于0.75 ，鑒定結(jié) 果才能被接受；而48或72小時培養(yǎng)后，值大于0.5時，鑒定結(jié)果才能被接受。

問題解答
如1-9列全是陽性，請確認：
1、確保該菌株適于用YT鑒定板來鑒定。
2、制作菌懸液時，確保不要將平板培養(yǎng)基（含氮源）也挑進接種液中。
3、菌懸液濃度不要過量，檢查并校正濁度儀。
4、確保菌懸液的均一，不含菌塊。
5、A1，D1孔作為對照孔，加液時不要少加，應與其它孔一致。
 
如1-9列全是陰性，請確認：
1、確保該菌株適于用 YT 鑒定板來鑒定。
2、需要新鮮培養(yǎng)的酵母菌，使用推薦的培養(yǎng)基BUY。
3、接種液和鑒定板使用前恢復到室溫，正確制備菌懸液，有合適的pH值和鹽度，不含防腐劑。
4、盡量用一次性的器皿處理細胞（洗刷過的器皿殘留的皂劑對細胞有毒害）。
5、接種液濃度要達到特定的濁度，檢查并校正濁度儀。
6、用正確的培養(yǎng)溫度進行培養(yǎng)。
7、A1，D1孔作為對照，不要將菌懸液加的過多，與其它孔保持一致。

局限性
       YT數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建是通過對微生物做大量代謝特征驗證后得到的。YT板通常只能鑒定包含在 當前數(shù)據(jù)庫中的菌株。非典型菌株通常只會報告“No Identification”。而培養(yǎng)72小時后SIM低 于0.5的都將報告為“No Identification ”。

質(zhì)控菌種
當用凍干菌株時，至少要傳兩代，使其恢復活性， 并調(diào)節(jié)其相應的生理狀態(tài)。
鑒定板培養(yǎng)48h，上讀數(shù)儀讀板。如果鑒定結(jié)果不符合，重新看一下操作流程，檢查菌株是否純。