利用染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(shù)ChIP-seq等揭示頭頸鱗癌免疫逃逸機制
免疫逃逸是癌癥進展的關(guān)鍵里程碑，是腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)。頭頸部鱗狀細胞癌（(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)）是全球最常見的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)治療選擇包括手術(shù)切除、放療和化療。最近，利用免疫檢查點抑制劑如PD-1/PD-L1單克隆抗體的免疫療法，已成為治療難治性復發(fā)/轉(zhuǎn)移HNSCC的有希望方法。但超過80%患者仍然表現(xiàn)出固有的藥物抗性，不能單獨從PD-1/PD-L1免疫療法中受益。其他免疫檢查點分子在HNSCC免疫逃逸中的潛力，影響抗PD-1/PD-L1免疫療法的效果。因此，進一步探索HNSCC免疫逃逸機制具有至關(guān)重要的意義。
人類乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV）感染與多種HNSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，HPV16、18、31、33和35等高風險類型，易于誘發(fā)各種人類惡性腫瘤，其中HPV16是最普遍的高風險亞型。最近發(fā)現(xiàn)HPV可以編碼環(huán)狀RNA（circRNA），而circE7是唯一被鑒定出由高風險HPV16特異性編碼的環(huán)狀RNA。circE7通過影響宿主細胞的表觀遺傳調(diào)控，可能參與腫瘤免疫逃逸和免疫治療抗性形成。但circE7的生物學功能仍然大部分未知，它在腫瘤免疫逃逸和免疫療法抗性中的參與尚未被報道。
2024年10月4日，中南大學博士后葛軍尚、博士生孟依、碩士生郭佳玥為并列第一作者，中南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院曾朝陽、熊煒和中南大學湘雅二醫(yī)院口腔醫(yī)學中心龔朝建為共同通訊作者，利用染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(shù)（ChIP-seq）等實驗揭示了HPV編碼的環(huán)狀RNA circE7促進頭頸部鱗狀細胞癌的免疫逃逸機制。相關(guān)研究成果以“Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma”為題發(fā)表在Nature子刊《nature communications》上。
標題：Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma（HPV編碼的環(huán)狀RNA circE7促進頭頸部鱗狀細胞癌的免疫逃逸）
期刊：Nature Communications
影響因子： IF 14.7 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：RT-qPCR、RNA pulldown、western blot、ChIP-seq、RIP實驗、動物實驗等
本研究通過整合23對HNSCC腫瘤樣本及其鄰近正常組織，以及105個HNSCC患者的石蠟包埋樣本，結(jié)合細胞和動物實驗，首先觀察到circE7表達與HPV HNSCC臨床組織中浸潤的T細胞呈負相關(guān)。體外和體內(nèi)實驗進一步證實，circE7通過表觀遺傳機制下調(diào)LGALS9基因（編碼Galectin-9蛋白），從而抑制T細胞功能和活性，進而促進HNSCC免疫逃逸。而LGALS9基因編碼的galectin-9蛋白能夠與T細胞表面的TIM-3和PD-1等免疫檢查點分子結(jié)合，進而激活T細胞釋放細胞毒性細胞因子并抑制T細胞凋亡。circE7下調(diào)Galectin-9，導致CD8+T功能和活性受到抑制；而circE7下調(diào)LGALS9表達的具體分子機制是circE7結(jié)合并抑制乙酰輔酶A羧化酶1 (acetyl-CoA carboxylase 1, ACC1)的磷酸化和激活，降低細胞內(nèi)乙酰輔酶A水平，導致LGALS9啟動子區(qū)域H3K27乙�；浇档�，通過表觀遺傳調(diào)控抑制LGALS9的表達；最后通過體內(nèi)外模型證實聯(lián)合使用TIM-3 (Galectin-9在T細胞上的受體)與PD-1單克隆抗體能顯著提高HNSCC的免疫治療效果。②
總之，本研究展示了HPV通過circE7驅(qū)動的表觀遺傳修飾促進HNSCC免疫逃逸機制，并提出了聯(lián)合使用抗PD-1和抗TIM-3抑制劑的HNSCC潛在免疫治療策略，這種聯(lián)合治療選擇可以增強HNSCC免疫療法的效果，為頭頸鱗癌免疫治療提供了新靶點和潛在治療策略。
結(jié)果圖形
（1）circE7在HPV+（陽性）的HNSCC中表達，并與T細胞浸潤和galectin-9表達呈負相關(guān)。
圖1：circE7在HPV+ HNSCC中高表達，且與CD8+ T細胞功能和免疫檢查點galectin-9表達呈負相關(guān)。A. 通過設(shè)計跨剪接位點引物并使用Sanger測序，鑒定circE7為通過HPV16 E6尾部、E7和部分E1序列的反向剪接形成的472nt環(huán)狀RNA。
B. 使用23個HNSCC組織進行RT-qPCR檢測CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表達，并分析了它們與circE7表達的相關(guān)性。與circE7陰性樣本相比，circE7陽性HNSCC樣本中CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表達顯著降低。（circE7陰性，n=16；circE7陽性，n=7）。
C. 在105個HNSCC組織中，通過原位雜交檢測circE7表達。通過免疫組化檢測浸潤CD8+ T細胞中p16、HPV16 E7蛋白和CD8A的表達。在這105個HNSCC病例中，有17個是HPV陽性，所有這些病例都是HPV16陽性且circE7表達。circE7表達水平與CD8+ T細胞浸潤呈負相關(guān)。（HPV陰性，n=88；HPV陽性，n=17）。
D-F. 在HPV陰性HNSCC細胞系CAL27和HN30中過表達circE7，或在HPV16陽性HNSCC細胞系SCC090和SCC154中轉(zhuǎn)染靶向circE7的siRNA。RT-qPCR（D）檢測LGALS9 mRNA，western blotting（E）和流式細胞術(shù)（F）檢測galectin-9蛋白表達。
G. 在（B）中使用的23個新鮮HNSCC組織樣本上進行RT-qPCR檢測LGALS9 mRNA。與circE7陰性組織相比，circE7陽性HNSCC組織中LGALS9 mRNA水平顯著降低。（circE7陰性，n=16；circE7陽性，n=7）。
H. 通過免疫組化在（C）中使用的105個HNSCC組織上檢測galectin-9表達，并分析其與circE7表達的相關(guān)性。（circE7陰性，n=88；circE7陽性，n=17）。
（2）circE7通過下調(diào)LGALS9表達促進HNSCC免疫逃逸
圖2：circE7下調(diào)HNSCC細胞中g(shù)alectin-9表達，以體外抑制CD8+ T細胞功能。
在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細胞中，過表達或敲低LGALS9，隨后與人原代T細胞以1:10的比例共培養(yǎng)6小時。
A. 通過RT-qPCR檢測原代T細胞中IFNG、GZMB和TNFA的表達水平。在CAL27和HN30細胞系中，同時過表達circE7和LGALS9。在SCC090和SCC154細胞系中，同時敲低circE7和LGALS9。然后將這些細胞與人原代T細胞共培養(yǎng)6小時。
B. T-qPCR用于檢測IFNG、GZMB和TNFA mRNA表達。
C. 通過ELISA檢測共培養(yǎng)基中IFN-γ、GZMB和TNF-α的水平。
D-E. 流式細胞術(shù)以鑒定總CD8+ T細胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T細胞的比例。
F. 通過Annexin V/PI染色后進行流式細胞術(shù)以評估凋亡CD8+ T細胞比例。
G. 使用Annexin V/PI染色后進行流式細胞術(shù)以凋亡腫瘤細胞比例。
（3）Galectin-9通過與TIM-3和PD-1結(jié)合增強CD8+ T細胞的抗腫瘤活性
圖3：Galectin-9通過與TIM-3和PD-1結(jié)合增強T細胞的功能和活性。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細胞中，進行Galectin-9過表達或敲低，然后加入10mg/mL乳糖，并與人原代T細胞以1:10比例共培養(yǎng)6小時。
A. 流式細胞術(shù)檢測總CD8+ T細胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細胞的百分比。
B. 使用Annexin V/PI檢測評估CD8+ T細胞的凋亡水平。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細胞中，進行Galectin-9過表達或敲低，然后加入5μg/mL抗PD-1和抗TIM-3，并與人原代T細胞以1:10的比例共培養(yǎng)6小時。
C. 流式細胞術(shù)檢測總CD8+ T細胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細胞的百分比。
D. 使用Annexin V/PI檢測評估CD8+ T細胞的凋亡水平。此外，人原代T細胞與1μg/mL重組Galectin-9蛋白共培養(yǎng)，同時加入抗TIM-3、抗PD-1和乳糖。
E. 使用Annexin V/PI檢測評估CD8+ T細胞的凋亡水平。
F. 流式細胞術(shù)檢測總CD8+ T細胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細胞的百分比。人原代CD8+ T細胞與1μg/mL重組Galectin-9、HMGB1蛋白和抗TIM-3共培養(yǎng)。
G. 流式細胞術(shù)檢測總CD8+ T細胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細胞的百分比。BSA為陰性對照。
H. 流式細胞術(shù)檢測附著在CD8+ T細胞表面的Galectin-9和HMGB1蛋白水平。
（4）circE7結(jié)合并激活A(yù)CC1以抑制乙酰輔酶A（acetyl-CoA）并抑制Galectin-9表達
圖4：circE7表觀遺傳下調(diào)ACC1介導的Galectin-9表達。
A. 使用生物素標記的circE7探針進行RNA pulldown分析，以檢測CAL27和HN30細胞中circE7與ACC1蛋白之間的結(jié)合。非生物素標記的circE7探針用作對照。
B. 在circE7過表達的CAL27和HN30細胞、或HPV陽性SCC090和SCC154細胞中，使用抗ACC1抗體進行RIP檢測ACC1蛋白與circE7的結(jié)合，然后RT-qPCR定量分析。
C. 使用抗Flag抗體進行RNA免疫沉淀，以評估ACC1蛋白與其截斷突變體與circE7的結(jié)合，然后對circE7進行RT-qPCR分析。
D. 使用生物素標記的circE7探針進行RNA pulldown，并使用抗Flag抗體進行western blot，以檢測circE7與ACC1及其截斷突變體之間的結(jié)合。
E. 使用抗ACC1抗體進行RNA免疫沉淀，以評估ACC1蛋白與circE7及其截斷突變體之間的直接結(jié)合，然后對circE7及其截斷突變體進行RT-qPCR分析。
F. 使用生物素標記的circE7探針進行RNA pulldown，以研究circE7及其截斷突變體與ACC1蛋白之間的結(jié)合。在CAL27和HN30細胞中過表達circE7，或在SCC090和SCC154細胞中轉(zhuǎn)染si-circE7。
G. western blot檢測總ACC1蛋白和p-ACC1蛋白的表達水平。
H. 使用乙酰輔酶A檢測試劑盒檢測細胞裂解物中的乙酰輔酶A含量。
I. western blot檢測整體乙�；谋磉_水平。
J. western blot 檢測H3K27 Ac、H3K9 Ac、H3K14 Ac和H3K23 Ac的表達水平。
K. 在HN30細胞中過表達circE7，ChIP-seq peaks顯示LGALS9啟動子區(qū)域的H3K27ac水平。橫軸代表基因組坐標，縱軸代表ChIP-seq信號強度。
L. ChIP-qPCR用于研究在CAL27和HN30細胞中過表達circE7或在SCC090和SCC154細胞中敲低circE7后LGALS9啟動子區(qū)域H3K27乙�；阶兓�
圖4-1：HN30細胞中過表達circE7的ChIP-seq和ChIP-qPCR分析。
M. 在HN30細胞中過表達circE7，CHIP-seq peaks顯示H3K27ac的整體水平。
N. hockey stick plot顯示在HN30細胞中，與Vector和OE-circE7相比，突出顯示SE相關(guān)基因的input歸一化、等級排序的H3K27ac信號。
O. 在GSE1855312和ENCODE數(shù)據(jù)庫中分析LGALS9啟動子區(qū)域的H3K27Ac水平。
圖5：ACC1是circE7在LGALS9轉(zhuǎn)錄表觀遺傳調(diào)控中的關(guān)鍵下游調(diào)控靶點。
A. 三個ACC1 siRNA被轉(zhuǎn)染到CAL27和HN30細胞中，或在SCC090和SCC154細胞中過表達ACC1，使用RT-qPCR檢測LGALS9 mRNA表達水平。
B. 使用Western blot檢測ACC1和galectin-9蛋白的表達水平。在CAL27和HN30細胞中過表達circE7的同時敲低ACC1，或者在SCC090和SCC154細胞中敲低circE7的同時過表達ACC1。
C. 使用RT-qPCR檢測LGALS9 mRNA的表達水平。
D. 使用Western blot檢測ACC1、H3K27 Ac和galectin-9蛋白的水平。在CAL27和HN30細胞中過表達circE7的同時加入ACC1的小分子抑制劑TOFA。
E. 使用RT-qPCR檢測LGALS9 mRNA的表達水平。
F. 使用Western blot檢測H3K27Ac和galectin-9蛋白水平。
（5）TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合應(yīng)用大大提高了HNSCC免疫治療效果
圖6：外源性TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療增強了CD8+ T細胞的細胞毒性功能。
CAL27和HN30細胞進行circE7過表達，或SCC090和SCC154細胞circE7敲低，然后與人原代T細胞共培養(yǎng)6小時，加入5μg/mL抗PD-1或抗PD-1/TIM-3。
A. 使用RT-qPCR檢測CD8+ T細胞中IFNG、GZMB和TNFA mRNA的表達水平。
B. 使用流式細胞術(shù)檢測所有CD8+ T細胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T細胞的比例。
C-D. 使用Annexin V/PI染色評估CD8+ T細胞（C）和腫瘤細胞（D）的凋亡水平。
圖7：TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療顯著提高了HNSCC免疫治療效果。
裸鼠通過右后肢注射1×10^6過表達circE7的HN30細胞或載體對照，或注射敲低circE7或NC對照的SCC090細胞來形成異種移植腫瘤。7天和14天后，注射人原代T細胞和20μg/每個的抗PD-1或抗PD-1/TIM-3進行免疫治療。
A-B. T細胞被標記為DeepRed，進行體內(nèi)成像以檢測攜帶腫瘤小鼠中人原代T細胞的生存和分布（每組n=3）。A 代表性圖像；B 注射后1、3、5和7天收集的腫瘤部位（右大腿底部）的DiR熒光信號與T細胞熒光強度比率的統(tǒng)計結(jié)果。顏色標尺代表小鼠T細胞的DiR熒光強度。
C. 代表性腫瘤圖像。左圖，HN30細胞注射后24天（每組n=6）；右圖，SCC090細胞注射后56天（每組n=6）。
D. 每周實時測量注射HN30或SCC090細胞的小鼠的腫瘤體積（每組n=6）。
E. 通過免疫組化檢測石蠟包埋的HN30和SCC090異種移植腫瘤中Galectin-9表達，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析（每組n=6）。
F. 通過免疫組化檢測HN30和SCC090異種移植腫瘤中CD8A的表達，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析（每組n=6）。
圖8：小鼠原位移植模型顯示PD-1和TIM-3單克隆抗體的聯(lián)合使用增強了HNSCC免疫治療的療效。C3H小鼠在右側(cè)臉頰注射2×10^5過表達circE7的SCC-7細胞或載體對照，形成異種移植腫瘤。3天后，注射20μg/次的抗PD-1或抗PD-1/TIM-3進行免疫治療。
A. 代表性腫瘤圖像（每組n=7）。
B. 腫瘤體積在SCC-7細胞注射后3天、7天和10天的測量結(jié)果（每組n=7）。
C. 注射SCC-7細胞后10天測量的腫瘤重量（每組n=7）。
D. 從小鼠腫瘤組織中制備單細胞懸浮液，通過RT-qPCR檢測IFNG、GZMB和TNFA mRNA表達（每組n=3）。
E. 使用ELISA檢測IFN-γ、GZMB和TNF-α的含量（每組n=3）。
F-G. 流式細胞術(shù)檢測CD8+ T細胞的比例（F）以及總CD8+ T細胞群中IFN-γ+ TNF-α+細胞的百分比（G）（每組n=3）。
H. 通過免疫組化檢測SCC-7異種移植腫瘤中Cd8A表達，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析（每組n=5）。
I. 通過免疫組化檢測石蠟包埋的SCC-7異種移植腫瘤中g(shù)alectin-9表達，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析（每組n=5）。
參考文獻：
人類乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV）感染與多種HNSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，HPV16、18、31、33和35等高風險類型，易于誘發(fā)各種人類惡性腫瘤，其中HPV16是最普遍的高風險亞型。最近發(fā)現(xiàn)HPV可以編碼環(huán)狀RNA（circRNA），而circE7是唯一被鑒定出由高風險HPV16特異性編碼的環(huán)狀RNA。circE7通過影響宿主細胞的表觀遺傳調(diào)控，可能參與腫瘤免疫逃逸和免疫治療抗性形成。但circE7的生物學功能仍然大部分未知，它在腫瘤免疫逃逸和免疫療法抗性中的參與尚未被報道。
2024年10月4日，中南大學博士后葛軍尚、博士生孟依、碩士生郭佳玥為并列第一作者，中南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院曾朝陽、熊煒和中南大學湘雅二醫(yī)院口腔醫(yī)學中心龔朝建為共同通訊作者，利用染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(shù)（ChIP-seq）等實驗揭示了HPV編碼的環(huán)狀RNA circE7促進頭頸部鱗狀細胞癌的免疫逃逸機制。相關(guān)研究成果以“Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma”為題發(fā)表在Nature子刊《nature communications》上。
期刊：Nature Communications
影響因子： IF 14.7 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：RT-qPCR、RNA pulldown、western blot、ChIP-seq、RIP實驗、動物實驗等
本研究通過整合23對HNSCC腫瘤樣本及其鄰近正常組織，以及105個HNSCC患者的石蠟包埋樣本，結(jié)合細胞和動物實驗，首先觀察到circE7表達與HPV HNSCC臨床組織中浸潤的T細胞呈負相關(guān)。體外和體內(nèi)實驗進一步證實，circE7通過表觀遺傳機制下調(diào)LGALS9基因（編碼Galectin-9蛋白），從而抑制T細胞功能和活性，進而促進HNSCC免疫逃逸。而LGALS9基因編碼的galectin-9蛋白能夠與T細胞表面的TIM-3和PD-1等免疫檢查點分子結(jié)合，進而激活T細胞釋放細胞毒性細胞因子并抑制T細胞凋亡。circE7下調(diào)Galectin-9，導致CD8+T功能和活性受到抑制；而circE7下調(diào)LGALS9表達的具體分子機制是circE7結(jié)合并抑制乙酰輔酶A羧化酶1 (acetyl-CoA carboxylase 1, ACC1)的磷酸化和激活，降低細胞內(nèi)乙酰輔酶A水平，導致LGALS9啟動子區(qū)域H3K27乙�；浇档�，通過表觀遺傳調(diào)控抑制LGALS9的表達；最后通過體內(nèi)外模型證實聯(lián)合使用TIM-3 (Galectin-9在T細胞上的受體)與PD-1單克隆抗體能顯著提高HNSCC的免疫治療效果。②
總之，本研究展示了HPV通過circE7驅(qū)動的表觀遺傳修飾促進HNSCC免疫逃逸機制，并提出了聯(lián)合使用抗PD-1和抗TIM-3抑制劑的HNSCC潛在免疫治療策略，這種聯(lián)合治療選擇可以增強HNSCC免疫療法的效果，為頭頸鱗癌免疫治療提供了新靶點和潛在治療策略。
結(jié)果圖形
（1）circE7在HPV+（陽性）的HNSCC中表達，并與T細胞浸潤和galectin-9表達呈負相關(guān)。
B. 使用23個HNSCC組織進行RT-qPCR檢測CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表達，并分析了它們與circE7表達的相關(guān)性。與circE7陰性樣本相比，circE7陽性HNSCC樣本中CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表達顯著降低。（circE7陰性，n=16；circE7陽性，n=7）。
C. 在105個HNSCC組織中，通過原位雜交檢測circE7表達。通過免疫組化檢測浸潤CD8+ T細胞中p16、HPV16 E7蛋白和CD8A的表達。在這105個HNSCC病例中，有17個是HPV陽性，所有這些病例都是HPV16陽性且circE7表達。circE7表達水平與CD8+ T細胞浸潤呈負相關(guān)。（HPV陰性，n=88；HPV陽性，n=17）。
D-F. 在HPV陰性HNSCC細胞系CAL27和HN30中過表達circE7，或在HPV16陽性HNSCC細胞系SCC090和SCC154中轉(zhuǎn)染靶向circE7的siRNA。RT-qPCR（D）檢測LGALS9 mRNA，western blotting（E）和流式細胞術(shù)（F）檢測galectin-9蛋白表達。
G. 在（B）中使用的23個新鮮HNSCC組織樣本上進行RT-qPCR檢測LGALS9 mRNA。與circE7陰性組織相比，circE7陽性HNSCC組織中LGALS9 mRNA水平顯著降低。（circE7陰性，n=16；circE7陽性，n=7）。
H. 通過免疫組化在（C）中使用的105個HNSCC組織上檢測galectin-9表達，并分析其與circE7表達的相關(guān)性。（circE7陰性，n=88；circE7陽性，n=17）。
（2）circE7通過下調(diào)LGALS9表達促進HNSCC免疫逃逸
圖2：circE7下調(diào)HNSCC細胞中g(shù)alectin-9表達，以體外抑制CD8+ T細胞功能。
A. 通過RT-qPCR檢測原代T細胞中IFNG、GZMB和TNFA的表達水平。在CAL27和HN30細胞系中，同時過表達circE7和LGALS9。在SCC090和SCC154細胞系中，同時敲低circE7和LGALS9。然后將這些細胞與人原代T細胞共培養(yǎng)6小時。
B. T-qPCR用于檢測IFNG、GZMB和TNFA mRNA表達。
C. 通過ELISA檢測共培養(yǎng)基中IFN-γ、GZMB和TNF-α的水平。
D-E. 流式細胞術(shù)以鑒定總CD8+ T細胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T細胞的比例。
F. 通過Annexin V/PI染色后進行流式細胞術(shù)以評估凋亡CD8+ T細胞比例。
G. 使用Annexin V/PI染色后進行流式細胞術(shù)以凋亡腫瘤細胞比例。
（3）Galectin-9通過與TIM-3和PD-1結(jié)合增強CD8+ T細胞的抗腫瘤活性
圖3：Galectin-9通過與TIM-3和PD-1結(jié)合增強T細胞的功能和活性。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細胞中，進行Galectin-9過表達或敲低，然后加入10mg/mL乳糖，并與人原代T細胞以1:10比例共培養(yǎng)6小時。
B. 使用Annexin V/PI檢測評估CD8+ T細胞的凋亡水平。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細胞中，進行Galectin-9過表達或敲低，然后加入5μg/mL抗PD-1和抗TIM-3，并與人原代T細胞以1:10的比例共培養(yǎng)6小時。
C. 流式細胞術(shù)檢測總CD8+ T細胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細胞的百分比。
D. 使用Annexin V/PI檢測評估CD8+ T細胞的凋亡水平。此外，人原代T細胞與1μg/mL重組Galectin-9蛋白共培養(yǎng)，同時加入抗TIM-3、抗PD-1和乳糖。
E. 使用Annexin V/PI檢測評估CD8+ T細胞的凋亡水平。
F. 流式細胞術(shù)檢測總CD8+ T細胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細胞的百分比。人原代CD8+ T細胞與1μg/mL重組Galectin-9、HMGB1蛋白和抗TIM-3共培養(yǎng)。
G. 流式細胞術(shù)檢測總CD8+ T細胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細胞的百分比。BSA為陰性對照。
H. 流式細胞術(shù)檢測附著在CD8+ T細胞表面的Galectin-9和HMGB1蛋白水平。
（4）circE7結(jié)合并激活A(yù)CC1以抑制乙酰輔酶A（acetyl-CoA）并抑制Galectin-9表達
圖4：circE7表觀遺傳下調(diào)ACC1介導的Galectin-9表達。
B. 在circE7過表達的CAL27和HN30細胞、或HPV陽性SCC090和SCC154細胞中，使用抗ACC1抗體進行RIP檢測ACC1蛋白與circE7的結(jié)合，然后RT-qPCR定量分析。
C. 使用抗Flag抗體進行RNA免疫沉淀，以評估ACC1蛋白與其截斷突變體與circE7的結(jié)合，然后對circE7進行RT-qPCR分析。
D. 使用生物素標記的circE7探針進行RNA pulldown，并使用抗Flag抗體進行western blot，以檢測circE7與ACC1及其截斷突變體之間的結(jié)合。
E. 使用抗ACC1抗體進行RNA免疫沉淀，以評估ACC1蛋白與circE7及其截斷突變體之間的直接結(jié)合，然后對circE7及其截斷突變體進行RT-qPCR分析。
F. 使用生物素標記的circE7探針進行RNA pulldown，以研究circE7及其截斷突變體與ACC1蛋白之間的結(jié)合。在CAL27和HN30細胞中過表達circE7，或在SCC090和SCC154細胞中轉(zhuǎn)染si-circE7。
G. western blot檢測總ACC1蛋白和p-ACC1蛋白的表達水平。
H. 使用乙酰輔酶A檢測試劑盒檢測細胞裂解物中的乙酰輔酶A含量。
I. western blot檢測整體乙�；谋磉_水平。
J. western blot 檢測H3K27 Ac、H3K9 Ac、H3K14 Ac和H3K23 Ac的表達水平。
K. 在HN30細胞中過表達circE7，ChIP-seq peaks顯示LGALS9啟動子區(qū)域的H3K27ac水平。橫軸代表基因組坐標，縱軸代表ChIP-seq信號強度。
L. ChIP-qPCR用于研究在CAL27和HN30細胞中過表達circE7或在SCC090和SCC154細胞中敲低circE7后LGALS9啟動子區(qū)域H3K27乙�；阶兓�
圖4-1：HN30細胞中過表達circE7的ChIP-seq和ChIP-qPCR分析。
N. hockey stick plot顯示在HN30細胞中，與Vector和OE-circE7相比，突出顯示SE相關(guān)基因的input歸一化、等級排序的H3K27ac信號。
O. 在GSE1855312和ENCODE數(shù)據(jù)庫中分析LGALS9啟動子區(qū)域的H3K27Ac水平。
圖5：ACC1是circE7在LGALS9轉(zhuǎn)錄表觀遺傳調(diào)控中的關(guān)鍵下游調(diào)控靶點。
B. 使用Western blot檢測ACC1和galectin-9蛋白的表達水平。在CAL27和HN30細胞中過表達circE7的同時敲低ACC1，或者在SCC090和SCC154細胞中敲低circE7的同時過表達ACC1。
C. 使用RT-qPCR檢測LGALS9 mRNA的表達水平。
D. 使用Western blot檢測ACC1、H3K27 Ac和galectin-9蛋白的水平。在CAL27和HN30細胞中過表達circE7的同時加入ACC1的小分子抑制劑TOFA。
E. 使用RT-qPCR檢測LGALS9 mRNA的表達水平。
F. 使用Western blot檢測H3K27Ac和galectin-9蛋白水平。
（5）TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合應(yīng)用大大提高了HNSCC免疫治療效果
圖6：外源性TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療增強了CD8+ T細胞的細胞毒性功能。
A. 使用RT-qPCR檢測CD8+ T細胞中IFNG、GZMB和TNFA mRNA的表達水平。
B. 使用流式細胞術(shù)檢測所有CD8+ T細胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T細胞的比例。
C-D. 使用Annexin V/PI染色評估CD8+ T細胞（C）和腫瘤細胞（D）的凋亡水平。
圖7：TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療顯著提高了HNSCC免疫治療效果。
A-B. T細胞被標記為DeepRed，進行體內(nèi)成像以檢測攜帶腫瘤小鼠中人原代T細胞的生存和分布（每組n=3）。A 代表性圖像；B 注射后1、3、5和7天收集的腫瘤部位（右大腿底部）的DiR熒光信號與T細胞熒光強度比率的統(tǒng)計結(jié)果。顏色標尺代表小鼠T細胞的DiR熒光強度。
C. 代表性腫瘤圖像。左圖，HN30細胞注射后24天（每組n=6）；右圖，SCC090細胞注射后56天（每組n=6）。
D. 每周實時測量注射HN30或SCC090細胞的小鼠的腫瘤體積（每組n=6）。
E. 通過免疫組化檢測石蠟包埋的HN30和SCC090異種移植腫瘤中Galectin-9表達，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析（每組n=6）。
F. 通過免疫組化檢測HN30和SCC090異種移植腫瘤中CD8A的表達，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析（每組n=6）。
A. 代表性腫瘤圖像（每組n=7）。
B. 腫瘤體積在SCC-7細胞注射后3天、7天和10天的測量結(jié)果（每組n=7）。
C. 注射SCC-7細胞后10天測量的腫瘤重量（每組n=7）。
D. 從小鼠腫瘤組織中制備單細胞懸浮液，通過RT-qPCR檢測IFNG、GZMB和TNFA mRNA表達（每組n=3）。
E. 使用ELISA檢測IFN-γ、GZMB和TNF-α的含量（每組n=3）。
F-G. 流式細胞術(shù)檢測CD8+ T細胞的比例（F）以及總CD8+ T細胞群中IFN-γ+ TNF-α+細胞的百分比（G）（每組n=3）。
H. 通過免疫組化檢測SCC-7異種移植腫瘤中Cd8A表達，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析（每組n=5）。
I. 通過免疫組化檢測石蠟包埋的SCC-7異種移植腫瘤中g(shù)alectin-9表達，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析（每組n=5）。
參考文獻：
- Ge, J., Meng, Y., Guo, J. et al. Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma. Nat Commun 15, 8609 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-52981-4
- 中南大學湘雅二醫(yī)院官網(wǎng)：湘雅二醫(yī)院口腔醫(yī)學中心龔朝建團隊揭示頭頸鱗癌發(fā)病新機制 https://www.xyeyy.com/2/17/content_80964.html
標簽：
ChIP-seq
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