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使用光片顯微鏡進(jìn)行人類早期大腦類器官發(fā)育的形態(tài)動(dòng)力學(xué)研究

瀏覽次數(shù)：3076　發(fā)布日期：2024-10-25　來源：徠卡顯微鏡

腦類器官使得人類大腦發(fā)育的機(jī)制研究成為可能，并提供了在不受限制的發(fā)育系統(tǒng)中探索自我組織形成的機(jī)會(huì)，類器官的成像觀察是理解其微觀結(jié)構(gòu)和功能的重要手段（文獻(xiàn)1）。由于人腦類器官的尺寸較大，組織致密，發(fā)育緩慢，且在幾周到幾個(gè)月的發(fā)育過程中需要無菌成像條件，使得對(duì)人腦類器官的活體成像特別是長(zhǎng)時(shí)間，面臨巨大挑戰(zhàn)。

在本例中，作者建立了長(zhǎng)期的活體光片顯微鏡技術(shù)，應(yīng)用于由熒光標(biāo)記的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成的無指導(dǎo)腦類器官，這使得我們能夠在類器官發(fā)育的數(shù)周內(nèi)跟蹤組織形態(tài)、細(xì)胞行為和亞細(xì)胞特征，為研究人類大腦形態(tài)動(dòng)力學(xué)提供了新的途徑，并支持基質(zhì)相關(guān)的機(jī)械感知?jiǎng)討B(tài)在大腦區(qū)域化過程中發(fā)揮核心作用的觀點(diǎn)。

稀疏和多位點(diǎn)熒光標(biāo)記腦類器官的
長(zhǎng)期活體成像

01、類器官的培養(yǎng)
本研究中使用的細(xì)胞系為：

❖Histone2B-mEGFP 均勻標(biāo)記細(xì)胞核
❖mEGFP-Beta-Actin 均勻標(biāo)記 ACTB
❖mTagRFP–T–CAAX 標(biāo)記細(xì)胞膜
❖mTagRFP–T-LaminB1 標(biāo)記 LMNB1
❖未標(biāo)記的 WTC iPSCs

操作流程：

干細(xì)胞系按標(biāo)準(zhǔn)流程培養(yǎng)和傳代
96孔板，每孔加入500個(gè)細(xì)胞/3000個(gè)細(xì)胞，在 mTSR+中（加入1:200 ROCKi和1:200Pen-strep），并以 200g離心5分鐘以生成胚體（EBs）
在第 2 天更換新鮮的 mTSR+，加入1:200 ROCKi 和 1:200 Pen-strep
第 4 天提供含 2%溶解的 matrigel 的新鮮神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并每隔一天更換一次
第 10 天提供含 2% matrigel 的分化培養(yǎng)基-VitA，并在第 15 天提供含 1% matrigel 的分化培養(yǎng)基+ VitA
第 15 天將類器官轉(zhuǎn)移到 24 孔板中，每孔一個(gè)類器官，并轉(zhuǎn)移到搖床上，隨后在一個(gè)月時(shí)將每孔一個(gè)類器官轉(zhuǎn)移到 6 孔板中，并保持在搖床上
嵌入基質(zhì)膠中，并培養(yǎng)在樣本室微孔中的細(xì)胞球用于光片成像

圖1.腦類器官培養(yǎng) a)本研究開發(fā)的流程示意圖（流程I）和之前的多區(qū)域人腦類器官（流程II）b)在兩種細(xì)胞接種濃度下，聚集后第4天類器官大小的比較，比例尺為500μm c)顯示在兩種不同的流程下，第8-11天類器官生長(zhǎng)的名稱圖像 d)樣品保持室的照片，包含四個(gè)分隔的子室，每個(gè)子室有四個(gè)微孔，用于生長(zhǎng)和成像16個(gè)不用的類器官，每個(gè)微孔一個(gè)。

02、長(zhǎng)期活體成像觀察

胚胎體（4 個(gè)）嵌入溶解在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的 20-50%基質(zhì)膠中或覆蓋在 0.6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖上。

圖2.稀疏和多位點(diǎn)熒光標(biāo)記腦類器官的長(zhǎng)期活體成像.f、4 個(gè)不同類器官（第 15 天）的 3D 投影（左）和橫截面（右），用全切片熒光原位雜交鏈反應(yīng)（HCR）染色標(biāo)記轉(zhuǎn)錄本。比例，100 微米。g) 從 188 小時(shí)成像實(shí)驗(yàn)中 75 小時(shí)成像的最大投影圖像。類器官包含 5 種不同的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系具有穩(wěn)定的蛋白質(zhì)遺傳標(biāo)記，使用紅色或綠色熒光蛋白（RFP，GFP），以及未標(biāo)記的細(xì)胞。比例，100 微米。h) 組織器切片（84 小時(shí)）顯示核膜（Lamin，RFP，品紅色）、質(zhì)膜標(biāo)記（CAAX，RFP，品紅色）、肌動(dòng)蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，品紅色）和細(xì)胞核（組蛋白，GFP，綠色）。i) 不同時(shí)間點(diǎn)的圖像顯示最大強(qiáng)度投影（左半部分）和切片（右半部分）。

每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。成像使用 Viventis LS1 Live 光片顯微鏡進(jìn)行，具體設(shè)置如下：

物鏡——25X NA1.1水鏡
成像視野——710μm
xy 像素大小——0.347μm
Z軸步徑——2μm，201 步
采集幀率為——30 分鐘

外源性細(xì)胞外基質(zhì)影響大腦類
器官的形態(tài)發(fā)生

為了量化類器官之間的形態(tài)動(dòng)態(tài)變化，作者利Viventis LS2光片顯微鏡低光毒性、多位點(diǎn)、多視角的成像能力，一次成像并行記錄16個(gè)類器官通過統(tǒng)計(jì)分析不同時(shí)間點(diǎn)類器官體積、腔室體積和腔室數(shù)量，結(jié)果突出了早期大腦類器官發(fā)育的三個(gè)形態(tài)動(dòng)力學(xué)階段，包括：

❖快速組織和腔體生長(zhǎng)的早期階段
❖涉及腔體融合事件的組織穩(wěn)定階段
❖神經(jīng)上皮成熟的最終階段

對(duì)比用基質(zhì)膠、低熔點(diǎn)瓊脂糖和不使用任何外源基質(zhì)培養(yǎng)類器官，使用光片長(zhǎng)時(shí)間跟蹤類器官動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示外源細(xì)胞外基質(zhì)的存在對(duì)人腦類器官的組織尺度形態(tài)發(fā)生有重大影響，且改變的組織極性可能會(huì)影響成熟神經(jīng)上皮中的細(xì)胞形態(tài)動(dòng)力學(xué)。

圖3.外源性細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)大腦類器官形態(tài)發(fā)生的影響。a) 類器官投影（第 7 天）顯示 16 個(gè)同時(shí)圖像采集，展示核膜（Lamin，RFP，橙色）、質(zhì)膜標(biāo)記（CAAX，RFP，橙色）、肌動(dòng)蛋白（GFP，青色）、微管蛋白（RFP，橙色）和細(xì)胞核（組蛋白，GFP，青色）。最大投影（左）和橫截面（右）b) 來自同一類器官在不同時(shí)間點(diǎn)的靜態(tài)圖，顯示橫截面并突出腔體形態(tài)（虛線）c) 類器官的橫截面顯示分段腔體和類器官上皮分割圖。d) 第 4-9 天每天測(cè)量的類器官總體積e) 圖表顯示隨時(shí)間變化的所有腔體的總體積f) 圖表顯示隨時(shí)間變化的分段腔體總數(shù)的變化。g) 類器官的橫截面顯示腔體形成和融合的過程m) 細(xì)胞外微環(huán)境的示意圖及與之對(duì)應(yīng)的明場(chǎng)圖像，顯示用 Matrigel（外部 ECM）培養(yǎng)的類器官、沒有任何外部嵌入（內(nèi)部 ECM）和低熔點(diǎn)瓊脂嵌入（擴(kuò)散屏障）。n) 示意圖顯示光片實(shí)驗(yàn)設(shè)置，以獲取不同嵌入處理的 16 倍類器官的同步成像。o) 第 9 天的圖像靜幀，顯示沒有任何嵌入和帶有瓊脂擴(kuò)散屏障的類器官的最大投影（左）和橫截面（右）。p) 用 Matrigel 培養(yǎng)的類器官、沒有基質(zhì)和帶有擴(kuò)散屏障的類器官中分段腔的 3D 渲染。q-r) 圖表顯示從第 4 天到第 9 天每天測(cè)量的所有成像類器官的總體積（q）、分段腔的總數(shù)變化（r）以及所有腔的總?cè)萘侩S時(shí)間的變化（s）誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差。t) 圖像顯示了在使用基質(zhì)膠或無基質(zhì)生長(zhǎng)的類器官（第 15 天）上進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)的橫截面，并染色以顯示細(xì)胞核（DAPI）、COL4A1 和 CDH2。所有圖像的比例尺為 100 μm。

單細(xì)胞形態(tài)類型分析揭示了發(fā)育中的
類器官內(nèi)形狀的轉(zhuǎn)變

研究人員利用多位點(diǎn)標(biāo)記的質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白、微管、核膜和組蛋白評(píng)估細(xì)胞形態(tài)變化在早期大腦類器官發(fā)育過程中對(duì)細(xì)胞的影響。通過開發(fā)的圖像分析流程：圖像預(yù)處理→亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分割→結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)→特征提取→解多通道→形態(tài)特征分析，揭示了兩個(gè)主要的核（組蛋白、層粘連蛋白）和細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白、微管、膜）結(jié)構(gòu)組。

通過高分辨率聚類，將結(jié)構(gòu)分組為形態(tài)類型，即具有相似形態(tài)特征（如體積、曲率、軸長(zhǎng)的細(xì)胞簇，使用PAGA軌跡分析識(shí)別組織中的結(jié)構(gòu)變化梯度，量化了多能干細(xì)胞向早期神經(jīng)外胚層的過渡，基于細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)和組織拓?fù)渥兓纬沙墒斓纳窠?jīng)上皮。

通過對(duì)每種基質(zhì)條件（基質(zhì)膠、瓊脂糖和無外源基質(zhì)）下，對(duì)每一天成像的類器官進(jìn)行標(biāo)記結(jié)構(gòu)的分割以及形態(tài)學(xué)分類分析，結(jié)果表明在沒有基質(zhì)膠作為外部細(xì)胞外基質(zhì)的情況下生成的類器官在組織拓?fù)渖习l(fā)生了變化，包含更大比例的非排列和非延長(zhǎng)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)類型的異質(zhì)性更高，并且未形成均勻的神經(jīng)外胚層和神經(jīng)上皮。

圖4. 使用接多路多位點(diǎn)細(xì)胞標(biāo)簽的細(xì)胞和細(xì)胞核形態(tài)轉(zhuǎn)變。a)分析策略示意圖。b) 第 6 天的類器官最大強(qiáng)度投影，標(biāo)記有核膜（Lamin，RFP，粉色）、質(zhì)膜（CAAX，RFP，粉色）、肌動(dòng)蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，粉色）和細(xì)胞核（組蛋白，GFP，綠色）c) 解通道圖像（Lamin，深棕色；CAAX，橙色；肌動(dòng)蛋白，藍(lán)色；微管蛋白，品紅色；組蛋白，綠色） d) 基于形態(tài)特征提取的所有解多通道標(biāo)簽的 PAGA 初始化 UMAP 嵌入。e) PAGA 初始化 UMAP 嵌入顯示肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和 CAAX 標(biāo)簽的軸長(zhǎng)變化，以及使用組蛋白和 Lamin 分割測(cè)量的細(xì)胞核體積變化。PAGA 圖顯示平均簇年齡（天數(shù)）的變化，節(jié)點(diǎn)大小表示一個(gè)簇內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，邊寬反映兩個(gè)簇之間的連接強(qiáng)度。f) 在 matrigel 條件下，所有細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白）按其對(duì)齊指數(shù)（與最近的類器官表面法線的絕對(duì)余弦角）著色。比例范圍為 0-1，其中 1（紅色）對(duì)應(yīng)于與類器官表面垂直對(duì)齊的細(xì)胞。g) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入和 PAGA 圖顯示使用從基質(zhì)膠、無基質(zhì)和瓊脂糖條件下分割的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)類型聚類。圖基于提取的所有分割細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白）的形態(tài)測(cè)量。h) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入顯示細(xì)胞軸比隨時(shí)間變化，并疊加顯示使用 PAGA 圖的平均聚類年齡。PAGA 圖根據(jù)聚類的平均年齡從淺灰色到黑色進(jìn)行顏色編碼。i) 每個(gè)形態(tài)類型聚類的示例細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白）。j) 顯示標(biāo)記有肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞的類器官示例圖像，顯示按其形態(tài)類型聚類著色的細(xì)胞。k) 堆疊條形圖顯示在基質(zhì)膠、無基質(zhì)和瓊脂糖條件下各個(gè)肌動(dòng)蛋白形態(tài)類型聚類中細(xì)胞的比例。l) 圖像顯示在第 6 天基質(zhì)膠條件下的細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白）根據(jù)細(xì)胞對(duì)齊指數(shù)著色，以及在第 9 天無基質(zhì)和瓊脂糖條件下的細(xì)胞。m) 小提琴圖顯示在第 4 天到第 12 天所有三種條件下所有分割細(xì)胞的細(xì)胞對(duì)齊（肌動(dòng)蛋白）值。n) 線圖顯示在三種條件下香農(nóng)指數(shù)的變化，基于隨時(shí)間變化的每個(gè)簇的細(xì)胞數(shù)量（基質(zhì)膠 (n=3)、無基質(zhì) (n=3) 和瓊脂糖 (n=3)）。

矩陣通過調(diào)節(jié) WNT 通路影響類器官的
形態(tài)發(fā)生和模式形成

為了理解在不同基質(zhì)條件（基質(zhì)膠、瓊脂糖、無矩陣）下生長(zhǎng)的類器官中發(fā)展出的分子細(xì)胞狀態(tài)，我們對(duì)第 13 天的類器官進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，差異表達(dá)基因的基因本體分析顯示出多個(gè)信號(hào)通路的富集，包括WNT、Notch、FGF 和 Hippo 信號(hào)通路以及與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。

基質(zhì)膠誘導(dǎo)的神經(jīng)外胚層的強(qiáng)烈形態(tài)變化，以及在無基質(zhì)條件下 WNT 和 Hippo 信號(hào)通路的上調(diào)，測(cè)試了YAP調(diào)節(jié)對(duì)類器官發(fā)育的影響。綜合證實(shí)了我們應(yīng)用含有外部基底膜豐富的 ECM 的 matrigel，導(dǎo)致腔體擴(kuò)張并自我模式化為主要的頭側(cè)前腦區(qū)域，并且 YAP1 的激活和 WLS 表達(dá)水平的增加促進(jìn)了發(fā)育中的神經(jīng)上皮的尾部化。

在對(duì)人類早期腦類器官的形態(tài)動(dòng)力學(xué)研究中，Viventis LS2 Live光片顯微鏡以極低的光毒性，通過多視角、多位置、長(zhǎng)時(shí)程的活細(xì)胞成像，展現(xiàn)腦類器官的整個(gè)發(fā)育過程。在單次長(zhǎng)時(shí)程成像過程中，同時(shí)收集多個(gè)樣本在不同條件下的數(shù)據(jù)，結(jié)合自我開發(fā)的分析流程、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析、信號(hào)通路探索分析，展示了YAP1 在基質(zhì)介導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生和類器官模式化中發(fā)揮的作用。

總的來說，這一應(yīng)用案例為理解類器官發(fā)育的形態(tài)動(dòng)力學(xué)提供了技術(shù)進(jìn)步，提供了對(duì)基質(zhì)介導(dǎo)的神經(jīng)上皮信號(hào)通路的機(jī)制性見解，并為未來探索人類大腦發(fā)育過程中細(xì)胞外微環(huán)境鋪平了道路。

參考文獻(xiàn)：
1.Method of the Year 2017: Organoids. (2018). Nature Methods
2.Elke Gabriel et.al Human brain organoids assemble functionally integrated bilateral optic vesicles Cell Stem Cell 28, 1740–1757, October 7, 2021
3.Akanksha Jain et.al Morphodynamics of human early brain organoid development bioRxiv | August 21, 2023

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