RRBS揭示中藥材DNA甲基化變化及花粉調(diào)控種子休眠的表觀遺傳機(jī)制
滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）是一種著名的中藥材，其花藥在花粉成熟后表現(xiàn)出獨特的周期性開裂和閉合的生理特性。其種子具有“次生休眠”特性，導(dǎo)致發(fā)芽率低、繁殖效率差。種子休眠受植物激素（如赤霉素和脫落酸）含量及比例影響，而這些激素的合成基因表達(dá)又受溫度、光照和種子含水量等因素調(diào)控。此外，滇重樓的花藥在花粉成熟后會出現(xiàn)獨特的周期性開裂和閉合現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象對種子休眠的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
近日，昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院王斌教授團(tuán)隊通過RNA測序和DNA甲基化測序，比較了花粉和種子在花藥開裂與閉合過程中的基因表達(dá)和甲基化變化，并結(jié)合不同花粉授粉模型，分析了這些變化對種子休眠的調(diào)控機(jī)制。相關(guān)研究成果以“Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy”為題發(fā)表在《Frontiers in Plant Science》期刊。
研究人員結(jié)合RNA測序（RNA-seq）和簡化基因組DNA甲基化測序（RRBS）技術(shù)，分析了花藥開裂和閉合過程中花粉和種子的基因表達(dá)譜以及甲基化變化，并研究了低溫處理后的影響。通過KEGG通路富集分析，鑒定出溫度相關(guān)甲基化變化敏感的基因簇（clusters）。
研究設(shè)置四種花粉處理模型：正常對照組、“低溫保護(hù)花粉”組、“剛開裂花藥的花粉”組和“閉合阻斷花藥的花粉”組，通過人工授粉產(chǎn)生相應(yīng)的種子。隨后利用qRT-PCR技術(shù)驗證在不同處理條件下，授粉種子中標(biāo)記基因表達(dá)模式變化。
通過轉(zhuǎn)錄組分析，研究者鑒定出花藥與正常組織之間的差異顯著表達(dá)基因，以及與低溫處理花粉和種子相關(guān)的甲基化變化基因區(qū)域。氧化磷酸化（ko00190）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）和玉米素生物合成（ko00908）三條信號通路表現(xiàn)出顯著的基因表達(dá)和甲基化變化富集。尤其是NADH-泛醌氧化還原酶鏈5、質(zhì)膜ATP酶4、細(xì)胞色素c氧化酶亞基2、玉米素-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、ABA不敏感蛋白5類似蛋白4和吲哚-3-乙酸酰胺合成酶（IAAS）等被鑒定為易受溫度誘導(dǎo)的甲基化變化影響的基因簇。
不同花粉授粉模型的評估結(jié)果顯示，IAAS、蔗糖合成酶（SUS）、赤霉素2-氧化酶（GA2ox）、ABA不敏感蛋白2（ABI2）和生長素抑制蛋白（ARP）這五個與休眠調(diào)控相關(guān)的標(biāo)記基因在閉合阻斷花藥的花粉、低溫保護(hù)的花粉以及剛開裂花藥的花粉三種情況均表現(xiàn)出差異表達(dá)模式。閉合阻斷花藥處理導(dǎo)致IAAS、SUS、GA2ox和ABI2的表達(dá)顯著上調(diào)，而ARP表達(dá)則顯著下調(diào)，這表明閉合阻斷花藥處理傾向于延長種子休眠期。而在低溫保護(hù)的花藥模型中，SUS、ARP、GA2ox和IAAS的表達(dá)水平降低，ABI2表達(dá)上調(diào)，總體上促進(jìn)種子萌發(fā)。
研究方法及結(jié)果
樣本收集：滇重樓的花藥、花粉粒和種子
研究方法及結(jié)果：
1. 轉(zhuǎn)錄組分析：發(fā)現(xiàn)花藥開裂和閉合狀態(tài)的基因表達(dá)存在顯著差異，閉合花藥中基因表達(dá)水平更高，且與能量代謝和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因顯著富集。
2. DNA甲基化分析：對不同處理的花粉和種子進(jìn)行RRBS分析，檢測DNA甲基化變化。RRBS結(jié)果顯示，低溫處理的花粉和種子中，氧化磷酸化、植物激素信號和玉米素生物合成等通路中的基因易發(fā)生甲基化變化。
3. 基因表達(dá)與甲基化的關(guān)聯(lián)分析：低溫處理導(dǎo)致花粉和種子中某些基因的甲基化水平發(fā)生變化，進(jìn)而影響其表達(dá)水平。例如，NADH-泛醌氧化還原酶鏈5（ND5）、質(zhì)膜ATP酶4（AHA4）和細(xì)胞色素c氧化酶亞基2（COX2）等基因在低溫處理后表達(dá)上調(diào)，而IAA-酰胺合成酶（IAAS）等基因表達(dá)下調(diào)。
4. 花粉處理模型對種子休眠的影響：通過人工授粉實驗發(fā)現(xiàn)，不同處理花粉模型（如低溫保護(hù)、阻止花藥閉合等）顯著改變了種子中與休眠調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)模式，如SUS、ARP、IAAS、GA2ox和ABI2等基因的表達(dá)水平發(fā)生變化，進(jìn)而影響種子的休眠與萌發(fā)。
RRBS在本研究中發(fā)揮關(guān)鍵作用
1. 檢測DNA甲基化變化：RRBS用于分析低溫處理對花粉和種子基因組DNA甲基化的影響，揭示了氧化磷酸化、植物激素信號等通路中的基因甲基化變化。
2. 關(guān)聯(lián)基因表達(dá)與甲基化：通過RRBS分析，研究者發(fā)現(xiàn)低溫處理導(dǎo)致的甲基化變化與基因表達(dá)的調(diào)控密切相關(guān)，如ND5、AHA4和COX2等基因的甲基化水平變化與其表達(dá)上調(diào)一致，而IAAS等基因的甲基化變化則與其表達(dá)下調(diào)相關(guān)。
3. 揭示環(huán)境因素對基因調(diào)控的影響：RRBS結(jié)果表明，低溫作為一種環(huán)境因素，可以通過改變花粉和種子中特定基因的甲基化狀態(tài)，進(jìn)而影響其表達(dá)，從而調(diào)控種子的休眠與萌發(fā)，為理解環(huán)境因素對植物基因表達(dá)和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了重要依據(jù)。
關(guān)鍵結(jié)果圖形
本研究采用RRBS分析滇重樓花粉和種子的全基因組甲基化情況，構(gòu)建的滇重樓RRBS文庫經(jīng)亞硫酸鹽處理，非甲基化C到T的轉(zhuǎn)化率超97%。測序分析結(jié)果顯示，經(jīng)過4°C低溫處理的花粉（4-H）和25°C處理的花粉（25-H）分別產(chǎn)生46.68 Gb和34.22 Gb的數(shù)據(jù)，而經(jīng)過-85°C處理的種子（85-Z）和4°C處理的種子（4-Z）分別產(chǎn)生71.76 Gb和74.4 Gb的數(shù)據(jù)（表1）。
表1：低溫處理花粉和種子甲基化測序結(jié)果的質(zhì)控數(shù)據(jù)
圖1：從轉(zhuǎn)錄組比較中差異表達(dá)基因富集的KEGG通路與差異DNA甲基化基因富集的通路重疊。
A. 開花藥組（T1–T3）與正常組織（T12–T15）的差異基因富集分析顯示，最顯著KEGG通路是植物激素信號（Ko04075）。
B. 閉花藥組（T4–T6）與正常組織（T12–T15）的差異基因富集分析表明，最顯著KEGG通路是淀粉和蔗糖代謝以及氧化磷酸化（Ko00190）。
C. 開花藥組（T1–T3）與閉花藥組（T4–T6）的差異基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最顯著KEGG通路。
D. 4°C和25°C不同溫度處理的花藥甲基化差異基因富集分析表明，最顯著KEGG通路是氧化磷酸化（Ko00190）。
E. -85°C和4°C不同溫度處理的種子甲基化差異基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最顯著通路之一。
F. 轉(zhuǎn)錄組和甲基化分析中富集的重疊通路分析表明，影響花粉發(fā)育基因表達(dá)的關(guān)鍵酶因溫度下降而發(fā)生甲基化變化，這與種子的行為一致。
酶1（enzyme1）：NADH-泛醌氧化還原酶鏈5；酶2：質(zhì)膜ATP酶4；酶3：細(xì)胞色素c氧化酶亞基2；酶4：玉米素-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；酶5：ABA不敏感蛋白5類似蛋白4；酶6：吲哚-3-乙酸酰胺合成酶。
圖2：花粉和種子中易發(fā)生甲基化變化的基因可能通過農(nóng)業(yè)和生物學(xué)中的信號通路影響種子休眠。
易小結(jié)：研究亮點
1. 揭示花藥開裂與閉合的基因表達(dá)差異：首次系統(tǒng)地分析了滇重樓花藥開裂和閉合狀態(tài)下的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)閉合花藥中與能量代謝相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)。
2. 低溫對花粉和種子甲基化的調(diào)控機(jī)制：明確了低溫處理通過改變花粉和種子中特定基因的甲基化水平，進(jìn)而影響其表達(dá)，為理解環(huán)境因素對種子休眠的調(diào)控提供了新的視角。
3. 花粉處理對種子休眠的調(diào)控作用：通過不同花粉處理模型，證實了花粉的生理狀態(tài)和環(huán)境處理可以通過改變種子中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式來調(diào)控種子的休眠與萌發(fā)，為滇重樓的人工繁殖提供了新的思路。
參考文獻(xiàn)：Wang M, Wang Q, Wang X, Wang D, Yin X,Qiao Y, Ma M, Du Y and Wang B (2024) Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy.Front. Plant Sci. 15:1389357.doi: 10.3389/fpls.2024.1389357
近日，昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院王斌教授團(tuán)隊通過RNA測序和DNA甲基化測序，比較了花粉和種子在花藥開裂與閉合過程中的基因表達(dá)和甲基化變化，并結(jié)合不同花粉授粉模型，分析了這些變化對種子休眠的調(diào)控機(jī)制。相關(guān)研究成果以“Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy”為題發(fā)表在《Frontiers in Plant Science》期刊。
研究設(shè)置四種花粉處理模型：正常對照組、“低溫保護(hù)花粉”組、“剛開裂花藥的花粉”組和“閉合阻斷花藥的花粉”組，通過人工授粉產(chǎn)生相應(yīng)的種子。隨后利用qRT-PCR技術(shù)驗證在不同處理條件下，授粉種子中標(biāo)記基因表達(dá)模式變化。
通過轉(zhuǎn)錄組分析，研究者鑒定出花藥與正常組織之間的差異顯著表達(dá)基因，以及與低溫處理花粉和種子相關(guān)的甲基化變化基因區(qū)域。氧化磷酸化（ko00190）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）和玉米素生物合成（ko00908）三條信號通路表現(xiàn)出顯著的基因表達(dá)和甲基化變化富集。尤其是NADH-泛醌氧化還原酶鏈5、質(zhì)膜ATP酶4、細(xì)胞色素c氧化酶亞基2、玉米素-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、ABA不敏感蛋白5類似蛋白4和吲哚-3-乙酸酰胺合成酶（IAAS）等被鑒定為易受溫度誘導(dǎo)的甲基化變化影響的基因簇。
不同花粉授粉模型的評估結(jié)果顯示，IAAS、蔗糖合成酶（SUS）、赤霉素2-氧化酶（GA2ox）、ABA不敏感蛋白2（ABI2）和生長素抑制蛋白（ARP）這五個與休眠調(diào)控相關(guān)的標(biāo)記基因在閉合阻斷花藥的花粉、低溫保護(hù)的花粉以及剛開裂花藥的花粉三種情況均表現(xiàn)出差異表達(dá)模式。閉合阻斷花藥處理導(dǎo)致IAAS、SUS、GA2ox和ABI2的表達(dá)顯著上調(diào)，而ARP表達(dá)則顯著下調(diào)，這表明閉合阻斷花藥處理傾向于延長種子休眠期。而在低溫保護(hù)的花藥模型中，SUS、ARP、GA2ox和IAAS的表達(dá)水平降低，ABI2表達(dá)上調(diào)，總體上促進(jìn)種子萌發(fā)。
研究方法及結(jié)果
樣本收集：滇重樓的花藥、花粉粒和種子
研究方法及結(jié)果：
1. 轉(zhuǎn)錄組分析：發(fā)現(xiàn)花藥開裂和閉合狀態(tài)的基因表達(dá)存在顯著差異，閉合花藥中基因表達(dá)水平更高，且與能量代謝和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因顯著富集。
2. DNA甲基化分析：對不同處理的花粉和種子進(jìn)行RRBS分析，檢測DNA甲基化變化。RRBS結(jié)果顯示，低溫處理的花粉和種子中，氧化磷酸化、植物激素信號和玉米素生物合成等通路中的基因易發(fā)生甲基化變化。
3. 基因表達(dá)與甲基化的關(guān)聯(lián)分析：低溫處理導(dǎo)致花粉和種子中某些基因的甲基化水平發(fā)生變化，進(jìn)而影響其表達(dá)水平。例如，NADH-泛醌氧化還原酶鏈5（ND5）、質(zhì)膜ATP酶4（AHA4）和細(xì)胞色素c氧化酶亞基2（COX2）等基因在低溫處理后表達(dá)上調(diào)，而IAA-酰胺合成酶（IAAS）等基因表達(dá)下調(diào)。
4. 花粉處理模型對種子休眠的影響：通過人工授粉實驗發(fā)現(xiàn)，不同處理花粉模型（如低溫保護(hù)、阻止花藥閉合等）顯著改變了種子中與休眠調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)模式，如SUS、ARP、IAAS、GA2ox和ABI2等基因的表達(dá)水平發(fā)生變化，進(jìn)而影響種子的休眠與萌發(fā)。
RRBS在本研究中發(fā)揮關(guān)鍵作用
1. 檢測DNA甲基化變化：RRBS用于分析低溫處理對花粉和種子基因組DNA甲基化的影響，揭示了氧化磷酸化、植物激素信號等通路中的基因甲基化變化。
2. 關(guān)聯(lián)基因表達(dá)與甲基化：通過RRBS分析，研究者發(fā)現(xiàn)低溫處理導(dǎo)致的甲基化變化與基因表達(dá)的調(diào)控密切相關(guān)，如ND5、AHA4和COX2等基因的甲基化水平變化與其表達(dá)上調(diào)一致，而IAAS等基因的甲基化變化則與其表達(dá)下調(diào)相關(guān)。
3. 揭示環(huán)境因素對基因調(diào)控的影響：RRBS結(jié)果表明，低溫作為一種環(huán)境因素，可以通過改變花粉和種子中特定基因的甲基化狀態(tài)，進(jìn)而影響其表達(dá)，從而調(diào)控種子的休眠與萌發(fā)，為理解環(huán)境因素對植物基因表達(dá)和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了重要依據(jù)。
關(guān)鍵結(jié)果圖形
本研究采用RRBS分析滇重樓花粉和種子的全基因組甲基化情況，構(gòu)建的滇重樓RRBS文庫經(jīng)亞硫酸鹽處理，非甲基化C到T的轉(zhuǎn)化率超97%。測序分析結(jié)果顯示，經(jīng)過4°C低溫處理的花粉（4-H）和25°C處理的花粉（25-H）分別產(chǎn)生46.68 Gb和34.22 Gb的數(shù)據(jù)，而經(jīng)過-85°C處理的種子（85-Z）和4°C處理的種子（4-Z）分別產(chǎn)生71.76 Gb和74.4 Gb的數(shù)據(jù)（表1）。
表1：低溫處理花粉和種子甲基化測序結(jié)果的質(zhì)控數(shù)據(jù)
圖1：從轉(zhuǎn)錄組比較中差異表達(dá)基因富集的KEGG通路與差異DNA甲基化基因富集的通路重疊。
B. 閉花藥組（T4–T6）與正常組織（T12–T15）的差異基因富集分析表明，最顯著KEGG通路是淀粉和蔗糖代謝以及氧化磷酸化（Ko00190）。
C. 開花藥組（T1–T3）與閉花藥組（T4–T6）的差異基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最顯著KEGG通路。
D. 4°C和25°C不同溫度處理的花藥甲基化差異基因富集分析表明，最顯著KEGG通路是氧化磷酸化（Ko00190）。
E. -85°C和4°C不同溫度處理的種子甲基化差異基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最顯著通路之一。
F. 轉(zhuǎn)錄組和甲基化分析中富集的重疊通路分析表明，影響花粉發(fā)育基因表達(dá)的關(guān)鍵酶因溫度下降而發(fā)生甲基化變化，這與種子的行為一致。
酶1（enzyme1）：NADH-泛醌氧化還原酶鏈5；酶2：質(zhì)膜ATP酶4；酶3：細(xì)胞色素c氧化酶亞基2；酶4：玉米素-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；酶5：ABA不敏感蛋白5類似蛋白4；酶6：吲哚-3-乙酸酰胺合成酶。
表2：低溫處理種子和花粉中 Methyl-Diff 基因和代謝通路的重疊分析。
圖3：驗證受精種子中花粉表達(dá)變化的基因
易小結(jié)：研究亮點
1. 揭示花藥開裂與閉合的基因表達(dá)差異：首次系統(tǒng)地分析了滇重樓花藥開裂和閉合狀態(tài)下的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)閉合花藥中與能量代謝相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)。
2. 低溫對花粉和種子甲基化的調(diào)控機(jī)制：明確了低溫處理通過改變花粉和種子中特定基因的甲基化水平，進(jìn)而影響其表達(dá)，為理解環(huán)境因素對種子休眠的調(diào)控提供了新的視角。
3. 花粉處理對種子休眠的調(diào)控作用：通過不同花粉處理模型，證實了花粉的生理狀態(tài)和環(huán)境處理可以通過改變種子中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式來調(diào)控種子的休眠與萌發(fā)，為滇重樓的人工繁殖提供了新的思路。
參考文獻(xiàn)：Wang M, Wang Q, Wang X, Wang D, Yin X,Qiao Y, Ma M, Du Y and Wang B (2024) Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy.Front. Plant Sci. 15:1389357.doi: 10.3389/fpls.2024.1389357
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