acRIP-seq在揭示哺乳動物mRNA乙酰化修飾ac4C形成的分子機制中的應(yīng)用
大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。
mRNA中存在大量的修飾堿基并塑造了表觀轉(zhuǎn)錄組，mRNA修飾在RNA代謝和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中N-4-乙酰胞嘧啶（ac4C）是唯一已知的RNA乙�；揎棥c4C在多種RNA中存在，并在不同細胞類型和物種間高度保守。盡管GCN5相關(guān)乙酰轉(zhuǎn)移酶10（NAT10）是ac4C已知的“writer”， 但乙�；^程的具體機制仍不清楚。因此，研究NAT10在mRNA乙�；械淖饔脵C制，以及相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白如何協(xié)助NAT10完成這一過程至關(guān)重要。
近日，浙江大學(xué)范衡宇團隊和欽州婦幼保健院吳洪波合作揭示哺乳動物細胞中mRNA ac4C修飾形成的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)NAT10與PCBP1/2和TDP43形成復(fù)合體，通過這些RNA結(jié)合蛋白作為接頭蛋白介導(dǎo)mRNA ac4C修飾。這一發(fā)現(xiàn)不僅闡明mRNA乙�；揎椀姆肿訖C制，還擴展了對mRNA乙酰化修飾及其位點偏好的認知。相關(guān)研究成果以“PCBP1/2 and TDP43 Function as NAT10 Adaptors to Mediate mRNA ac4C Formation in Mammalian Cells”為題發(fā)表于《Advanced Science》期刊。
mRNA中存在大量的修飾堿基并塑造了表觀轉(zhuǎn)錄組，mRNA修飾在RNA代謝和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中N-4-乙酰胞嘧啶（ac4C）是唯一已知的RNA乙�；揎棥c4C在多種RNA中存在，并在不同細胞類型和物種間高度保守。盡管GCN5相關(guān)乙酰轉(zhuǎn)移酶10（NAT10）是ac4C已知的“writer”， 但乙�；^程的具體機制仍不清楚。因此，研究NAT10在mRNA乙�；械淖饔脵C制，以及相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白如何協(xié)助NAT10完成這一過程至關(guān)重要。
近日，浙江大學(xué)范衡宇團隊和欽州婦幼保健院吳洪波合作揭示哺乳動物細胞中mRNA ac4C修飾形成的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)NAT10與PCBP1/2和TDP43形成復(fù)合體，通過這些RNA結(jié)合蛋白作為接頭蛋白介導(dǎo)mRNA ac4C修飾。這一發(fā)現(xiàn)不僅闡明mRNA乙�；揎椀姆肿訖C制，還擴展了對mRNA乙酰化修飾及其位點偏好的認知。相關(guān)研究成果以“PCBP1/2 and TDP43 Function as NAT10 Adaptors to Mediate mRNA ac4C Formation in Mammalian Cells”為題發(fā)表于《Advanced Science》期刊。
標(biāo)題：PCBP1/2 and TDP43 Function as NAT10 Adaptors to Mediate mRNA ac4C Formation in Mammalian Cells
發(fā)表時間：2024年11月18日
發(fā)表期刊：Advanced Science（Adv Sci）
影響因子： IF 14.3 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：acRIP-seq（易基因金牌技術(shù)）
本研究鑒定出NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體在哺乳動物細胞中介導(dǎo)mRNA ac4C形成，還鑒定出兩類RNA結(jié)合蛋白（RBPs）作為NAT10接頭蛋白負責(zé)mRNA的錨定和底物選擇，這兩類RBPs分別屬于poly（rC）結(jié)合蛋白1/2（PCBP1/2）和TAR DNA結(jié)合蛋白43（TDP43）家族。敲低這些接頭蛋白會導(dǎo)致HEK293T細胞中mRNA乙酰化水平降低，并消除富含胞嘧啶的ac4C motif。這些接頭蛋白還通過招募NAT10到其結(jié)合位點來影響ac4C位點。在小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體的存在，突顯了其在體內(nèi)潛在的生理功能。這些發(fā)現(xiàn)揭示了哺乳動物細胞中mRNA ac4C “writer”復(fù)合體的組成，并擴展了對mRNA乙�；揎椇蚢c4C位點偏好的認識。
研究方法
1. 蛋白質(zhì)互作分析：通過親和純化和質(zhì)譜分析，鑒定出與NAT10互作的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)PCBP1/2和TDP43與NAT10存在互作。
2. RNA免疫沉淀測序（acRIP-seq）和acRIP-qPCR：通過acRIP-seq技術(shù)，繪制了mRNA中ac4C的全轉(zhuǎn)錄組圖譜，分析了ac4C分布特征和偏好序列。并通過acRIP-qPCR驗證PCBP1/2和TDP43缺失時ac4C豐度變化。
3. 基因敲低實驗：利用siRNA技術(shù)敲低PCBP1/2和TDP43，通過HPLC-MS/MS檢測mRNA中ac4C的豐度變化，驗證這些蛋白在mRNA乙酰化中的作用。
4. RNA結(jié)合蛋白功能分析：通過免疫沉淀和RNA下拉實驗，研究PCBP1/2和TDP43在mRNA結(jié)合和乙�；械淖饔脵C制。
研究結(jié)果
（1）將PCBP1、PCBP2和TDP43鑒定為NAT10相關(guān)蛋白：通過親和純化和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)PCBP1/2和TDP43與NAT10存在相互作用，并且這種相互作用不依賴于RNA的存在。
圖1：鑒定和驗證TDP43和PCBP1/2是NAT10的接頭蛋白
A. 哺乳動物RNA中N-4-乙酰胞嘧啶形成的示意圖，THUMPD1和box C/D小核仁RNA（snoRNA）分別協(xié)助NAT10在tRNA和18S rRNA中產(chǎn)生ac4C修飾。而在mRNA ac4C形成過程中，假設(shè)的接頭蛋白仍然未知。
B. HEK293T細胞和小鼠睪丸中NAT10互作組的比較，表達N端FLAG標(biāo)簽的NAT10的HEK293T細胞和野生型（WT）小鼠睪丸分別用抗FLAG抗體和抗NAT10抗體進行親和純化，并進行質(zhì)譜分析。RBPs（包括PCBP1、PCBP2和TDP43）表現(xiàn)出對NAT10的親和力。
C. 共免疫沉淀（co-IP）結(jié)果顯示FLAG標(biāo)簽的NAT10與HA標(biāo)簽的TDP43、PCBP1和PCBP2之間互作，這種互作對RNase A消化具有抗性作用。
D. 內(nèi)源性免疫沉淀（endo-IP）結(jié)果顯示TDP43、NAT10和PCBP1/2在293T細胞中自發(fā)協(xié)調(diào)。
E-F. N端截短的PCBP1/2構(gòu)建圖和驗證NAT10與野生型或突變型PCBP之間互作。共免疫沉淀（co-IP）結(jié)果表明，PCBP1/2中的hnRNP K同源性（KH）1結(jié)構(gòu)域是其與NAT10結(jié)合的原因。
（2）PCBP1/2和TDP43為體內(nèi)胞嘧啶N-4乙�；匦瑁�RT-qPCR、western blotting和HPLC-MS/MS分析結(jié)果表明，PCBP1/2和TDP43特異性介導(dǎo)HEK293T細胞中poly（A）RNA ac4C形成。
B. HEK293T細胞和小鼠睪丸中NAT10互作組的比較，表達N端FLAG標(biāo)簽的NAT10的HEK293T細胞和野生型（WT）小鼠睪丸分別用抗FLAG抗體和抗NAT10抗體進行親和純化，并進行質(zhì)譜分析。RBPs（包括PCBP1、PCBP2和TDP43）表現(xiàn)出對NAT10的親和力。
C. 共免疫沉淀（co-IP）結(jié)果顯示FLAG標(biāo)簽的NAT10與HA標(biāo)簽的TDP43、PCBP1和PCBP2之間互作，這種互作對RNase A消化具有抗性作用。
D. 內(nèi)源性免疫沉淀（endo-IP）結(jié)果顯示TDP43、NAT10和PCBP1/2在293T細胞中自發(fā)協(xié)調(diào)。
E-F. N端截短的PCBP1/2構(gòu)建圖和驗證NAT10與野生型或突變型PCBP之間互作。共免疫沉淀（co-IP）結(jié)果表明，PCBP1/2中的hnRNP K同源性（KH）1結(jié)構(gòu)域是其與NAT10結(jié)合的原因。
（2）PCBP1/2和TDP43為體內(nèi)胞嘧啶N-4乙�；匦瑁�RT-qPCR、western blotting和HPLC-MS/MS分析結(jié)果表明，PCBP1/2和TDP43特異性介導(dǎo)HEK293T細胞中poly（A）RNA ac4C形成。
圖2：PCBP1/2和TDP43缺失導(dǎo)致HEK293T細胞中mRNA ac4C豐度降低。
A. RT-qPCR比較對照組（siNC）與PCBP1/2或TDP43敲低（siPCBP1/2和siTDP43）后PCBP1/2、TDP43和NAT10的mRNA表達水平。基因表達水平以GAPDH為基準(zhǔn)歸一化。平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM），n=3。使用雙尾學(xué)生t檢驗計算敲低組與siNC組之間的P值。***P < 0.001。n.s.，不顯著。
B. western blotting實驗比較對照組（siNC）與PCBP1/2或TDP43敲低組之間PCBP1/2、TDP43和NAT10的蛋白表達水平。DDB1為對照。
C-E. 通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測對照組以及PCBP1/2、TDP43或NAT10敲低組中總RNA、poly(A) RNA和non-poly(A) RNA中ac4C豐度（ac4C/C）。每種RNA類型的ac4C豐度均以siNC組為基準(zhǔn)進行歸一化。平均值±SEM。*P < 0.05，**P < 0.01。
F-H. 通過LC-MS/MS檢測對照組以及PCBP1/2、TDP43或NAT10敲低后poly (A) RNA中m6A、m5C和f5C的豐度（分別為m6A/A、m5C/C和f5C/C）。所指示的修飾豐度均以對照組為基準(zhǔn)進行歸一化。平均值±SEM。
（3）HEK293T細胞中mRNA乙�；碚鳎�通過acRIP-seq分析，發(fā)現(xiàn)ac4C在mRNA的5′-非翻譯區(qū)（5′-UTR）和翻譯起始位點（TIS）附近富集，且偏好于密碼子的擺動位點。
B. western blotting實驗比較對照組（siNC）與PCBP1/2或TDP43敲低組之間PCBP1/2、TDP43和NAT10的蛋白表達水平。DDB1為對照。
C-E. 通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測對照組以及PCBP1/2、TDP43或NAT10敲低組中總RNA、poly(A) RNA和non-poly(A) RNA中ac4C豐度（ac4C/C）。每種RNA類型的ac4C豐度均以siNC組為基準(zhǔn)進行歸一化。平均值±SEM。*P < 0.05，**P < 0.01。
F-H. 通過LC-MS/MS檢測對照組以及PCBP1/2、TDP43或NAT10敲低后poly (A) RNA中m6A、m5C和f5C的豐度（分別為m6A/A、m5C/C和f5C/C）。所指示的修飾豐度均以對照組為基準(zhǔn)進行歸一化。平均值±SEM。
（3）HEK293T細胞中mRNA乙�；碚鳎�通過acRIP-seq分析，發(fā)現(xiàn)ac4C在mRNA的5′-非翻譯區(qū)（5′-UTR）和翻譯起始位點（TIS）附近富集，且偏好于密碼子的擺動位點。
圖3：HEK293T細胞mRNA ac4C的全轉(zhuǎn)錄組范圍圖譜
A. ac4C RNA免疫沉淀測序分析（acRIP-seq）示意圖：使用oligo (dT)15磁珠從HEK293T細胞中提取的總RNA中富集poly(A) RNA，并進行抗ac4C抗體的親和純化、cDNA文庫構(gòu)建和進一步測序分析。
B-C. ac4C (+) poly(A) RNA的定義：根據(jù)轉(zhuǎn)錄本在ac4C富集組中相對于input組和IgG富集組的富集水平，定義WT（B）和siTDP43（C）組中的ac4C (+) poly(A) RNA。只有通過與input組和IgG組的雙尾Student's t檢驗的轉(zhuǎn)錄本被選為ac4C靶標(biāo)（P < 0.05）。FC表示倍數(shù)變化。
D. 熱圖顯示W(wǎng)T和siTDP43 mRNA中WT ac4C靶標(biāo)富集水平，顏色從紅到藍表示富集程度從高到低。
E. IGV瀏覽器視圖顯示RRBP1（高乙酰化）、ZFP36L2（中等乙酰化）和EEF1A1（未乙�；┺D(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄本reads，比對到人類參考基因組（hg19）。顯示acRIP、IgG富集和input組的reads。內(nèi)含子/外顯子（線/框）基因組結(jié)構(gòu)以深藍色顯示。
F. acRIP-seq鑒定的ac4C峰簇的富集序列motif分析。上：WT 293T mRNA中的ac4C motif（P=1.5E-70）。下：siTDP43 mRNA中的ac4C motif（P=3.1E-35）。
G. ac4C修飾轉(zhuǎn)錄本與TDP43結(jié)合的mRNA在293T細胞中的重疊。
H. TDP43結(jié)合的ac4C轉(zhuǎn)錄本的富集序列motif，顯示前2序列。
（4）PCBP1/2和TDP43缺失時ac4C豐度變化的acRIP-qPCR驗證：敲低PCBP1/2或TDP43會導(dǎo)致mRNA中ac4C豐度顯著降低，表明它們是NAT10介導(dǎo)mRNA乙�；年P(guān)鍵接頭蛋白。
B-C. ac4C (+) poly(A) RNA的定義：根據(jù)轉(zhuǎn)錄本在ac4C富集組中相對于input組和IgG富集組的富集水平，定義WT（B）和siTDP43（C）組中的ac4C (+) poly(A) RNA。只有通過與input組和IgG組的雙尾Student's t檢驗的轉(zhuǎn)錄本被選為ac4C靶標(biāo)（P < 0.05）。FC表示倍數(shù)變化。
D. 熱圖顯示W(wǎng)T和siTDP43 mRNA中WT ac4C靶標(biāo)富集水平，顏色從紅到藍表示富集程度從高到低。
E. IGV瀏覽器視圖顯示RRBP1（高乙酰化）、ZFP36L2（中等乙酰化）和EEF1A1（未乙�；┺D(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄本reads，比對到人類參考基因組（hg19）。顯示acRIP、IgG富集和input組的reads。內(nèi)含子/外顯子（線/框）基因組結(jié)構(gòu)以深藍色顯示。
F. acRIP-seq鑒定的ac4C峰簇的富集序列motif分析。上：WT 293T mRNA中的ac4C motif（P=1.5E-70）。下：siTDP43 mRNA中的ac4C motif（P=3.1E-35）。
G. ac4C修飾轉(zhuǎn)錄本與TDP43結(jié)合的mRNA在293T細胞中的重疊。
H. TDP43結(jié)合的ac4C轉(zhuǎn)錄本的富集序列motif，顯示前2序列。
（4）PCBP1/2和TDP43缺失時ac4C豐度變化的acRIP-qPCR驗證：敲低PCBP1/2或TDP43會導(dǎo)致mRNA中ac4C豐度顯著降低，表明它們是NAT10介導(dǎo)mRNA乙�；年P(guān)鍵接頭蛋白。
圖4：PCBP1/2和TDP43缺失導(dǎo)致野生型（WT）ac4C mRNA中ac4C豐度降低或乙�；揎椚笔А�
A. acRIP-qPCR分析示意圖：從對照組以及PCBP1/2、TDP43或NAT10敲低組中提取的RNA樣本與體外轉(zhuǎn)錄的含有ac4C的鼠β-珠蛋白探針和無ac4C的Egfp探針混合，并通過抗ac4C抗體偶聯(lián)的磁珠進行富集。通過親和純化富集的RNA進一步使用oligo(dT)30引物進行逆轉(zhuǎn)錄。
B-C. acRIP回收的18S和5S rRNA的RT-qPCR驗證結(jié)果，18S rRNA作為已知的ac4C靶標(biāo)對照。
D-F. RT-qPCR結(jié)果顯示低乙�；痬RNA（GAPDH和EEF1A1）、高乙酰化mRNA（RRBP1、RBBP6和UPF3B）以及中等乙酰化mRNA（FUS、ZFP36L2和LAMP1）在acRIP富集中的差異。
G-H. IGV瀏覽器視圖顯示含有或不含有5′-UTR乙酰化峰的ac4C靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本reads數(shù)（G中的UPF3B和H中的LAMP1）在對照組的ac4C富集、IgG富集和input樣本中的分布。展示5′-UTR和CDS中選定外顯子的放大視圖。UTR，非翻譯區(qū)。CDS，編碼序列。
I-J. RT-qPCR結(jié)果顯示UPF3B（I）和LAMP1（J）5′-UTR在各指示組中的富集水平變化。
（5）PCBP1/2和TDP43促進NAT10結(jié)合mRNA
B-C. acRIP回收的18S和5S rRNA的RT-qPCR驗證結(jié)果，18S rRNA作為已知的ac4C靶標(biāo)對照。
D-F. RT-qPCR結(jié)果顯示低乙�；痬RNA（GAPDH和EEF1A1）、高乙酰化mRNA（RRBP1、RBBP6和UPF3B）以及中等乙酰化mRNA（FUS、ZFP36L2和LAMP1）在acRIP富集中的差異。
G-H. IGV瀏覽器視圖顯示含有或不含有5′-UTR乙酰化峰的ac4C靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本reads數(shù)（G中的UPF3B和H中的LAMP1）在對照組的ac4C富集、IgG富集和input樣本中的分布。展示5′-UTR和CDS中選定外顯子的放大視圖。UTR，非翻譯區(qū)。CDS，編碼序列。
I-J. RT-qPCR結(jié)果顯示UPF3B（I）和LAMP1（J）5′-UTR在各指示組中的富集水平變化。
（5）PCBP1/2和TDP43促進NAT10結(jié)合mRNA
圖5：PCBP1/2和TDP43促進NAT10與偏好性ac4C修飾的mRNA結(jié)合
A. 內(nèi)源性RNA免疫沉淀（RIP）中免疫沉淀的PCBP1、PCBP2和TDP43的Western blot結(jié)果
B-D. RT-qPCR結(jié)果顯示PCBP1/2和TDP43以不同程度結(jié)合了非偏好性（GAPDH和EEF1A1）、高偏好性（RRBP1、RBBP6和UPF3B）和中等偏好性（FUS、ZFP36L2和LAMP1）的ac4C底物mRNA。
E-F. RT-qPCR結(jié)果顯示PCBP1/2和TDP43對偏好性乙�；揎椀膍RNA 5′-UTR的結(jié)合具有多樣性。
G. 通過抗NAT10抗體進行RIP的免疫沉淀Western blot結(jié)果：在對照組（siNC）和接頭蛋白缺失組（siPCBP1/2和siTDP43）中，檢測到NAT10、TDP43、PCBP1和PCBP2的免疫沉淀。當(dāng)PCBP1/2缺失時，TDP43與NAT10之間的相互作用得以維持。反之亦然。
H. NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體在mRNA乙酰化中的示意圖：在正常情況下，NAT10/PCBP1/TDP43形成一個穩(wěn)定的異源四聚體，PCBP通過其KH1結(jié)構(gòu)域與NAT10結(jié)合。通過結(jié)合mRNA，PCBP1/2和TDP43將NAT10招募到偏好性的mRNA上，NAT10將乙�；鶊F轉(zhuǎn)移到特定位點的胞嘧啶上。PCBP1/2或TDP43缺失會導(dǎo)致復(fù)合體不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合到非乙�；痬RNA底物上，甚至無法結(jié)合mRNA，從而導(dǎo)致異常的ac4C修飾。
I-K. RT-qPCR結(jié)果顯示在PCBP1/2和TDP43敲低后，NAT10與指示的偏好性乙酰化修飾mRNA之間的連接變化。
L-M. PCBP1/2和TDP43敲低后，NAT10與UPF3B（L）和LAMP1（M）mRNA 5′-UTR之間的連接變化RT-qPCR結(jié)果。
（6）PCBP1負責(zé)mRNA ac4C位點偏好
B-D. RT-qPCR結(jié)果顯示PCBP1/2和TDP43以不同程度結(jié)合了非偏好性（GAPDH和EEF1A1）、高偏好性（RRBP1、RBBP6和UPF3B）和中等偏好性（FUS、ZFP36L2和LAMP1）的ac4C底物mRNA。
E-F. RT-qPCR結(jié)果顯示PCBP1/2和TDP43對偏好性乙�；揎椀膍RNA 5′-UTR的結(jié)合具有多樣性。
G. 通過抗NAT10抗體進行RIP的免疫沉淀Western blot結(jié)果：在對照組（siNC）和接頭蛋白缺失組（siPCBP1/2和siTDP43）中，檢測到NAT10、TDP43、PCBP1和PCBP2的免疫沉淀。當(dāng)PCBP1/2缺失時，TDP43與NAT10之間的相互作用得以維持。反之亦然。
H. NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體在mRNA乙酰化中的示意圖：在正常情況下，NAT10/PCBP1/TDP43形成一個穩(wěn)定的異源四聚體，PCBP通過其KH1結(jié)構(gòu)域與NAT10結(jié)合。通過結(jié)合mRNA，PCBP1/2和TDP43將NAT10招募到偏好性的mRNA上，NAT10將乙�；鶊F轉(zhuǎn)移到特定位點的胞嘧啶上。PCBP1/2或TDP43缺失會導(dǎo)致復(fù)合體不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合到非乙�；痬RNA底物上，甚至無法結(jié)合mRNA，從而導(dǎo)致異常的ac4C修飾。
I-K. RT-qPCR結(jié)果顯示在PCBP1/2和TDP43敲低后，NAT10與指示的偏好性乙酰化修飾mRNA之間的連接變化。
L-M. PCBP1/2和TDP43敲低后，NAT10與UPF3B（L）和LAMP1（M）mRNA 5′-UTR之間的連接變化RT-qPCR結(jié)果。
（6）PCBP1負責(zé)mRNA ac4C位點偏好
圖6：PCBP1與mRNA之間親和影響ac4C位點偏好
A. IGV瀏覽器視圖顯示RRBP1第14-16外顯子的轉(zhuǎn)錄本reads，acRIP-seq中比對到人類參考基因組。根據(jù)PACES預(yù)測，RRBP1 exon15（第15外顯子）的核苷酸3299–3313（CGCCAGCUCCCGCGG）含有ac4C，進一步被指定為RRBP1位點（RRBP1site）。
B. RT-qPCR結(jié)果確認RRBP1 exon15 mRNA在對照組（siNC）中存在乙�；赑CBP1/2、TDP43或NAT10耗竭后丟失。
C. RT-qPCR結(jié)果顯示內(nèi)源性RIP中PCBP1與RRBP1 exon15 mRNA相互作用。
D. RT-qPCR結(jié)果顯示在TDP43和PCBP1/2敲除后，NAT10對RRBP1exon15 mRNA的親和力分別降低或喪失。
E. 用于RNA下拉實驗設(shè)計的RNA探針示意圖。RRBP1位點（RRBP1site）從HEK293T cDNA克隆，并通過體外轉(zhuǎn)錄直接或在中性突變后摻入生物素標(biāo)記尿嘧啶進行轉(zhuǎn)錄（將RRBP1位點中的大部分胞嘧啶替換為其他核苷酸，如C3299U、C3302G、C3305U、C3307G、C3308U、C3309A和C3311G，分別表示為RRBP1site1–WT和RRBP1site1–mut）。
F. RNA下拉結(jié)果顯示PCBP1/2對WT RRBP1位點具有特異性親和力。
G. RNA下拉結(jié)果顯示在對照組以及PCBP1/2、TDP43和NAT10敲低后，RRBP1 exon15與NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體亞基之間的親和力變化。
H. 使用胞嘧啶和乙�；奏ぬ结樳M行RNA下拉分析示意圖：WT和突變的RRBP1 exon15通過體外轉(zhuǎn)錄分別含有胞嘧啶和乙�；奏�。同時加入生物素標(biāo)記的尿嘧啶以進一步富集。將RNA探針與指示的細胞裂解液混合并進行親和下拉。
I. RNA下拉結(jié)果顯示PCBP/TDP43/NAT10復(fù)合體與指示的RNA探針之間的親和力。PCBP1特異性地與RRBP1 exon15相互作用，排除ac4C摻入，而PCBP2僅與ac4C(-) RNA相互作用。TDP43在含或不含ac4C的mRNA結(jié)合中沒有差異。使用ImageJ對條帶的灰度值進行定量，并以通過含有WT序列的探針下拉的對照組進行歸一化。
（7）PCBP1/2-TDP43/NAT10在小鼠睪丸中作為mRNA乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體發(fā)揮作用：在小鼠睪丸中也發(fā)現(xiàn)了類似的NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體，表明該復(fù)合體在不同細胞類型和物種中具有保守性。
B. RT-qPCR結(jié)果確認RRBP1 exon15 mRNA在對照組（siNC）中存在乙�；赑CBP1/2、TDP43或NAT10耗竭后丟失。
C. RT-qPCR結(jié)果顯示內(nèi)源性RIP中PCBP1與RRBP1 exon15 mRNA相互作用。
D. RT-qPCR結(jié)果顯示在TDP43和PCBP1/2敲除后，NAT10對RRBP1exon15 mRNA的親和力分別降低或喪失。
E. 用于RNA下拉實驗設(shè)計的RNA探針示意圖。RRBP1位點（RRBP1site）從HEK293T cDNA克隆，并通過體外轉(zhuǎn)錄直接或在中性突變后摻入生物素標(biāo)記尿嘧啶進行轉(zhuǎn)錄（將RRBP1位點中的大部分胞嘧啶替換為其他核苷酸，如C3299U、C3302G、C3305U、C3307G、C3308U、C3309A和C3311G，分別表示為RRBP1site1–WT和RRBP1site1–mut）。
F. RNA下拉結(jié)果顯示PCBP1/2對WT RRBP1位點具有特異性親和力。
G. RNA下拉結(jié)果顯示在對照組以及PCBP1/2、TDP43和NAT10敲低后，RRBP1 exon15與NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體亞基之間的親和力變化。
H. 使用胞嘧啶和乙�；奏ぬ结樳M行RNA下拉分析示意圖：WT和突變的RRBP1 exon15通過體外轉(zhuǎn)錄分別含有胞嘧啶和乙�；奏�。同時加入生物素標(biāo)記的尿嘧啶以進一步富集。將RNA探針與指示的細胞裂解液混合并進行親和下拉。
I. RNA下拉結(jié)果顯示PCBP/TDP43/NAT10復(fù)合體與指示的RNA探針之間的親和力。PCBP1特異性地與RRBP1 exon15相互作用，排除ac4C摻入，而PCBP2僅與ac4C(-) RNA相互作用。TDP43在含或不含ac4C的mRNA結(jié)合中沒有差異。使用ImageJ對條帶的灰度值進行定量，并以通過含有WT序列的探針下拉的對照組進行歸一化。
（7）PCBP1/2-TDP43/NAT10在小鼠睪丸中作為mRNA乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體發(fā)揮作用：在小鼠睪丸中也發(fā)現(xiàn)了類似的NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體，表明該復(fù)合體在不同細胞類型和物種中具有保守性。
圖7：NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體在小鼠睪丸中mRNA乙酰化中的功能
A. endo-IP結(jié)果顯示TDP43、NAT10和PCBP1/2在小鼠睪丸中的自發(fā)協(xié)調(diào)。使用抗TDP43抗體進行endo-IP。箭頭表示珠帶。
B. Western blot結(jié)果顯示從小鼠睪丸中通過流式細胞分選（FACS）分離的精母細胞中TDP43的表達。LZ：細線期(leptotene)和合子期(zygotene)，PD：粗線期(pachytene)和雙線期(diplotene)，MII：中期II(metaphase II)，RS：圓形精子細胞(round spermatids），α-微管蛋白對照。
C. 通過acRIP與input組和IgG富集組之間的富集豐度定義小鼠睪丸中乙酰化的mRNA。
D. 熱圖顯示小鼠睪丸中WT ac4C靶標(biāo)的富集水平，顏色從紅色到藍色表示富集程度從高到低。
E. 通過acRIP-seq在小鼠睪丸中鑒定的ac4C峰簇的富集序列motif分析。通過MEME分析檢測到CCHCAGSHC（H = C/U/A，S = C/G，P = 1.5E-7）motif。
F. IGV瀏覽器視圖顯示高乙酰化（Enho 3′-UTR）、中等乙�；℉oxd9）和未乙�；‥ef1a1）的轉(zhuǎn)錄本比對到小鼠參考基因組（mm10）。顯示了acRIP、IgG和input組的reads。內(nèi)含子/外顯子（線/框）基因組結(jié)構(gòu)以深藍色顯示。
G. RT-qPCR結(jié)果顯示高乙�；‥nho 3′-UTR）、中等乙�；℉oxd9）和低乙�；痬RNA（Eef1a1）的乙�；S度變化。
H. RT-qPCR結(jié)果顯示TDP43對小鼠睪丸中偏好性ac4C靶標(biāo)mRNA的親和力。
易小結(jié)
本研究首次揭示了NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體在mRNA乙�；械淖饔脵C制，明確了PCBP1/2和TDP43作為NAT10的接頭蛋白，協(xié)助mRNA的ac4C修飾形成的分子機制。同時，本研究通過acRIP-seq技術(shù)繪制了mRNA中ac4C的全轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了ac4C的分布特征和偏好序列，為研究mRNA乙酰化修飾提供了重要的數(shù)據(jù)支持。此外，本研究在小鼠睪丸中也發(fā)現(xiàn)了類似的NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體，表明該復(fù)合體在不同細胞類型和物種中具有保守性，為研究其生理功能提供了新的視角。
本研究為理解mRNA乙�；揎椀姆肿訖C制提供了重要的基礎(chǔ)，未來的研究方向可能包括：
B. Western blot結(jié)果顯示從小鼠睪丸中通過流式細胞分選（FACS）分離的精母細胞中TDP43的表達。LZ：細線期(leptotene)和合子期(zygotene)，PD：粗線期(pachytene)和雙線期(diplotene)，MII：中期II(metaphase II)，RS：圓形精子細胞(round spermatids），α-微管蛋白對照。
C. 通過acRIP與input組和IgG富集組之間的富集豐度定義小鼠睪丸中乙酰化的mRNA。
D. 熱圖顯示小鼠睪丸中WT ac4C靶標(biāo)的富集水平，顏色從紅色到藍色表示富集程度從高到低。
E. 通過acRIP-seq在小鼠睪丸中鑒定的ac4C峰簇的富集序列motif分析。通過MEME分析檢測到CCHCAGSHC（H = C/U/A，S = C/G，P = 1.5E-7）motif。
F. IGV瀏覽器視圖顯示高乙酰化（Enho 3′-UTR）、中等乙�；℉oxd9）和未乙�；‥ef1a1）的轉(zhuǎn)錄本比對到小鼠參考基因組（mm10）。顯示了acRIP、IgG和input組的reads。內(nèi)含子/外顯子（線/框）基因組結(jié)構(gòu)以深藍色顯示。
G. RT-qPCR結(jié)果顯示高乙�；‥nho 3′-UTR）、中等乙�；℉oxd9）和低乙�；痬RNA（Eef1a1）的乙�；S度變化。
H. RT-qPCR結(jié)果顯示TDP43對小鼠睪丸中偏好性ac4C靶標(biāo)mRNA的親和力。
易小結(jié)
本研究首次揭示了NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體在mRNA乙�；械淖饔脵C制，明確了PCBP1/2和TDP43作為NAT10的接頭蛋白，協(xié)助mRNA的ac4C修飾形成的分子機制。同時，本研究通過acRIP-seq技術(shù)繪制了mRNA中ac4C的全轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了ac4C的分布特征和偏好序列，為研究mRNA乙酰化修飾提供了重要的數(shù)據(jù)支持。此外，本研究在小鼠睪丸中也發(fā)現(xiàn)了類似的NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體，表明該復(fù)合體在不同細胞類型和物種中具有保守性，為研究其生理功能提供了新的視角。
本研究為理解mRNA乙�；揎椀姆肿訖C制提供了重要的基礎(chǔ)，未來的研究方向可能包括：
- 深入研究NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能：通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法，進一步解析該復(fù)合體的組裝機制和作用模式。
- 探索mRNA乙�；揎椀纳砉δ埽貉芯縜c4C修飾在細胞增殖、分化、發(fā)育以及疾病發(fā)生中的具體作用。
- 開發(fā)基于mRNA乙酰化修飾的診斷和治療策略：鑒于ac4C修飾在多種疾病中的異常表達，未來有望開發(fā)針對該修飾的診斷標(biāo)志物和治療靶點。
acRIP-seq技術(shù)在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用：
- 繪制ac4C全轉(zhuǎn)錄組圖譜：通過acRIP-seq，研究者能夠全面了解mRNA中ac4C的分布特征，包括其在5′-UTR和CDS中的富集情況，以及偏好序列。
- 驗證接頭蛋白的功能：通過比較野生型和敲低TDP43細胞系的acRIP-seq數(shù)據(jù)，研究者發(fā)現(xiàn)TDP43缺失導(dǎo)致ac4C修飾顯著減少，從而驗證了TDP43在mRNA乙酰化中的重要作用。
- 揭示了ac4C修飾的動態(tài)變化：acRIP-seq技術(shù)使得研究者能夠觀察到在不同基因敲低條件下ac4C修飾的變化，進一步揭示了NAT10/PCBP/TDP43復(fù)合體在mRNA乙酰化中的協(xié)同作用機制。
參考文獻：
Jiang ZY, Wu YK, Deng ZQ, Chen L, Zhu YM, Yu YS, Wu HB, Fan HY. PCBP1/2 and TDP43 Function as NAT10 Adaptors to Mediate mRNA ac4C Formation in Mammalian Cells. Adv Sci (Weinh). 2024 Nov 18:e2400133. doi: 10.1002/advs.202400133.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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