近紅外激光器與SilVIR探測器助力高級多色熒光共聚焦成像
激光掃描共聚焦顯微鏡是流行的生物研究工具。它們通常用于同時對多個熒光團進行成像，具有良好的色彩分離效果，還能通過增強的層切功能對生物標本內(nèi)部進行深層成像。
如今，炙手可熱的激光技術(shù)創(chuàng)新可使此類應(yīng)用受益，并實現(xiàn)高級別的實驗。在這篇文章中，我們將討論Evident的FV4000激光掃描共聚焦顯微鏡上的新型近紅外(NIR)方案如何為高級多色熒光成像提供動力。
讓我們先來了解一下多色成像實驗的歷史。多年來，許多研究人員都使用DAPI和其他兩種顏色（通常是綠色和紅色光譜）進行免疫熒光檢測。
隨著抗體和成像系統(tǒng)的發(fā)展，有了更多的探測器和更出色的發(fā)射波長濾色鏡，四色免疫熒光開始流行。最常見的四色組合是將DAPI、綠色、紅色和近紅外色組合在一張圖像中。
但有兩個關(guān)鍵因素阻礙了第五或第六個通道的引入：
1.缺乏光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管
首先，適合共聚焦顯微鏡的光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管并不容易獲得。足夠的功率（但不能過高）、極低的功率波動和兼容的光束輪廓都是用于共聚焦成像的激光二極管的必要特征。但直到最近，在這些波長范圍內(nèi)也只有少數(shù)近紅外激光二極管可供選擇。
但由于全新激光二極管技術(shù)的出現(xiàn)，徹底改變了這一局面。我們的FV4000共聚焦顯微鏡現(xiàn)在提供685nm、730nm和785nm激光二極管，用于高效激發(fā)諸如下表所示的二級染料。
2.近紅外波長靈敏度降低的光電倍增管
實現(xiàn)高效近紅外成像的第二個挑戰(zhàn)是，許多被用作激光掃描共聚焦顯微鏡標準探測器的光電倍增管(PMT)在近紅外波長區(qū)域（750nm以上）的典型檢測波長下靈敏度下降。
這種近紅外探測范圍內(nèi)靈敏度降低的情況，對于在可見光譜中部具有較高靈敏度的GaAsP PMT來說尤其如此。在750nm以上范圍內(nèi)，GaAsP探測器的靈敏度非常低。
為了克服這一挑戰(zhàn)，我們在FV4000激光共聚焦顯微鏡中采用了SilVIR探測技術(shù)。我們的SilVIR探測器利用硅光電倍增管(SiPM)，這是一種半導(dǎo)體傳感器，可在400nm到900nm的寬波長范圍內(nèi)采集高信噪比的熒光圖像。
得益于這項技術(shù)，我們的FV4000系統(tǒng)可提供多達6個通道的SilVIR探測器，用于多色熒光應(yīng)用。
與我們的X Line高性能物鏡配套使用，F(xiàn)LUOVEW FV4000系統(tǒng)可在400-1000nm范圍內(nèi)提供高質(zhì)量的寬色差校正。SilVIR探測器和X-Line物鏡的結(jié)合使多色熒光成像和整體近紅外成像的可靠性大大提高。
同時，近紅外成像的效率受到光路系統(tǒng)多方面的影響，物鏡的紅外透過率和檢測器的檢測效率毋庸置疑是核心因素，但對于激光掃描共聚焦系統(tǒng)，掃描單元的掃描振鏡涉及多次光路的傳輸，紅外的反射效率對圖像亮度的影響是指數(shù)級的，Evident共聚焦系統(tǒng)采用具有銀鍍膜的掃描振鏡，對比傳統(tǒng)鋁鍍膜，反射效率更高，在紅外波段的反射效率差異尤其明顯，這大大降低了紅外光信號的損失，保證了最終紅外信號的高靈敏探測。
秉承百年科學(xué)探索精神，Evident不斷為生命科學(xué)研究提供創(chuàng)新工具和解決方案，助力探索生命奧秘。想要進一步了解FV4000激光共聚焦顯微鏡如何助力您的科學(xué)研究，歡迎隨時聯(lián)系Evident申請演示，或識別以下二維碼，了解詳細的技術(shù)規(guī)格和案例應(yīng)用。
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如今，炙手可熱的激光技術(shù)創(chuàng)新可使此類應(yīng)用受益，并實現(xiàn)高級別的實驗。在這篇文章中，我們將討論Evident的FV4000激光掃描共聚焦顯微鏡上的新型近紅外(NIR)方案如何為高級多色熒光成像提供動力。
在共聚焦顯微鏡檢查中同步采集5個以上通道
利用FV4000系統(tǒng)克服技術(shù)挑戰(zhàn)
利用FV4000系統(tǒng)克服技術(shù)挑戰(zhàn)
讓我們先來了解一下多色成像實驗的歷史。多年來，許多研究人員都使用DAPI和其他兩種顏色（通常是綠色和紅色光譜）進行免疫熒光檢測。
隨著抗體和成像系統(tǒng)的發(fā)展，有了更多的探測器和更出色的發(fā)射波長濾色鏡，四色免疫熒光開始流行。最常見的四色組合是將DAPI、綠色、紅色和近紅外色組合在一張圖像中。
但有兩個關(guān)鍵因素阻礙了第五或第六個通道的引入：
1.缺乏光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管
首先，適合共聚焦顯微鏡的光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管并不容易獲得。足夠的功率（但不能過高）、極低的功率波動和兼容的光束輪廓都是用于共聚焦成像的激光二極管的必要特征。但直到最近，在這些波長范圍內(nèi)也只有少數(shù)近紅外激光二極管可供選擇。
但由于全新激光二極管技術(shù)的出現(xiàn)，徹底改變了這一局面。我們的FV4000共聚焦顯微鏡現(xiàn)在提供685nm、730nm和785nm激光二極管，用于高效激發(fā)諸如下表所示的二級染料。
| 激光 | 熒光染料 | λ_Ex (nm) | λ_Em (nm) |
|---|---|---|---|
| LD685 | Alexa Fluor 680 | 679 | 702 |
| DyLight 680 | 692 | 712 | |
| Alexa Fluor 700 | 696 | 719 | |
| iRFP720 | 702 | 720 | |
| LD730 | ATTO 740 | 743 | 763 |
| DiR | 750 | 782 | |
| Alexa Fluor 750 | 752 | 779 | |
| Cy7 | 753 | 775 | |
| DyLight 755 | 754 | 776 | |
| LD785 | DyLight 800 | 777 | 794 |
| IR Dye 800CW | 778 | 794 | |
| Alexa Fluor 790 | 782 | 805 | |
| Cy7.5 | 790 | 810 |
以上染料以及越來越多的新型熒光團使得增加第五和第六個同步通道進行多色成像變得更具吸引力。
2.近紅外波長靈敏度降低的光電倍增管
實現(xiàn)高效近紅外成像的第二個挑戰(zhàn)是，許多被用作激光掃描共聚焦顯微鏡標準探測器的光電倍增管(PMT)在近紅外波長區(qū)域（750nm以上）的典型檢測波長下靈敏度下降。
這種近紅外探測范圍內(nèi)靈敏度降低的情況，對于在可見光譜中部具有較高靈敏度的GaAsP PMT來說尤其如此。在750nm以上范圍內(nèi)，GaAsP探測器的靈敏度非常低。
為了克服這一挑戰(zhàn)，我們在FV4000激光共聚焦顯微鏡中采用了SilVIR探測技術(shù)。我們的SilVIR探測器利用硅光電倍增管(SiPM)，這是一種半導(dǎo)體傳感器，可在400nm到900nm的寬波長范圍內(nèi)采集高信噪比的熒光圖像。
利用近紅外標記，實現(xiàn)5~6色熒光同步光譜成像
得益于這項技術(shù)，我們的FV4000系統(tǒng)可提供多達6個通道的SilVIR探測器，用于多色熒光應(yīng)用。
與我們的X Line高性能物鏡配套使用，F(xiàn)LUOVEW FV4000系統(tǒng)可在400-1000nm范圍內(nèi)提供高質(zhì)量的寬色差校正。SilVIR探測器和X-Line物鏡的結(jié)合使多色熒光成像和整體近紅外成像的可靠性大大提高。
同時，近紅外成像的效率受到光路系統(tǒng)多方面的影響，物鏡的紅外透過率和檢測器的檢測效率毋庸置疑是核心因素，但對于激光掃描共聚焦系統(tǒng)，掃描單元的掃描振鏡涉及多次光路的傳輸，紅外的反射效率對圖像亮度的影響是指數(shù)級的，Evident共聚焦系統(tǒng)采用具有銀鍍膜的掃描振鏡，對比傳統(tǒng)鋁鍍膜，反射效率更高，在紅外波段的反射效率差異尤其明顯，這大大降低了紅外光信號的損失，保證了最終紅外信號的高靈敏探測。
秉承百年科學(xué)探索精神，Evident不斷為生命科學(xué)研究提供創(chuàng)新工具和解決方案，助力探索生命奧秘。想要進一步了解FV4000激光共聚焦顯微鏡如何助力您的科學(xué)研究，歡迎隨時聯(lián)系Evident申請演示，或識別以下二維碼，了解詳細的技術(shù)規(guī)格和案例應(yīng)用。
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