‌聚賴氨酸硅納米復(fù)合物制備及其體外轉(zhuǎn)染增效

摘要
溶膠-凝膠法結(jié)合靜電吸附策略制備了聚賴氨酸修飾的硅納米復(fù)合物（PLA-SiNPs），其粒徑為150±20 nm，表面電荷+25.3 mV，可高效負載質(zhì)粒DNA（包封率91.2±3.5%）。體外實驗表明，PLA-SiNPs的轉(zhuǎn)染效率達78.4±5.1%，較未修飾硅納米顆粒提升2.8倍，且細胞毒性顯著降低（存活率>95%），為基因遞送提供了新型高效載體。
‌引言‌
基因轉(zhuǎn)染效率是限制基因治療和功能研究的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)非病毒載體（如脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺）存在毒性高、穩(wěn)定性差等問題。硅納米顆粒（SiNPs）因其生物相容性和可修飾性受到關(guān)注，但表面負電荷限制了其與核酸的結(jié)合能力。

‌研究難點與創(chuàng)新點‌：
‌表面電荷調(diào)控‌：通過聚賴氨酸（PLA）修飾SiNPs，利用其陽離子特性增強DNA負載能力。
 
‌結(jié)構(gòu)優(yōu)化‌：溶膠-凝膠法控制SiNPs孔徑（5-10 nm），提升質(zhì)粒保護效果。
本研究系統(tǒng)優(yōu)化PLA-SiNPs的制備工藝，評估其理化性質(zhì)及體外轉(zhuǎn)染性能，并闡明其增效機制。
‌材料與方法‌
‌1. 實驗材料‌
試劑‌：
 
硅源：某試劑（正硅酸乙酯，TEOS）。
 
聚賴氨酸：某試劑（分子量15 kDa）。
 
質(zhì)粒DNA：某試劑（pEGFP-N1，4.7 kb）。
 
細胞‌：HEK293T細胞（某試劑）。
‌2. 實驗儀器‌
威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓150 V，脈沖10 ms）。
 
威尼德紫外交聯(lián)儀（用于DNA固定）。
 
透射電子顯微鏡（某品牌）。
‌3. PLA-SiNPs制備‌
‌硅納米顆粒合成‌：
 
將TEOS與氨水（pH 10）混合，50℃攪拌24 h，離心獲得SiNPs（粒徑80±10 nm）。
 
‌聚賴氨酸修飾‌：
 
將SiNPs與0.5% PLA溶液（pH 7.4）按質(zhì)量比1:5混合，威尼德紫外交聯(lián)儀處理（波長365 nm，10 min），離心純化得PLA-SiNPs。
 
‌4. 質(zhì)粒負載與表征‌
‌負載方法‌：
 
PLA-SiNPs與質(zhì)粒DNA（質(zhì)量比10:1）渦旋孵育30 min，超濾離心去除游離DNA。
 
‌包封率檢測‌：
 
納米顆粒懸液經(jīng)DNase I處理后，使用某試劑檢測釋放DNA濃度。
‌5. 體外轉(zhuǎn)染實驗‌
‌細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染‌：
 
HEK293T細胞接種于24孔板（密度5×10^4/孔），PLA-SiNPs/pDNA復(fù)合物（1 μg DNA/孔）孵育48 h。
 
‌效率檢測‌：
 
‌流式細胞術(shù)‌：分析GFP陽性細胞比例。
 
‌熒光顯微鏡‌：觀察綠色熒光表達強度。
 
‌細胞毒性‌：CCK-8法檢測細胞存活率。
‌6. 數(shù)據(jù)分析‌
使用SPSS 26.0進行t檢驗與單因素方差分析，顯著性閾值設(shè)為P<0.05。
‌結(jié)果‌
‌1. PLA-SiNPs的理化性質(zhì)‌

‌參數(shù)‌	‌SiNPs‌	‌PLA-SiNPs‌
粒徑（nm）	80±10	150±20
Zeta電位（mV）	-15.2±1.8	+25.3±2.1
DNA包封率（%）	32.7±4.2	91.2±3.5

‌2. 體外轉(zhuǎn)染效率‌
‌流式分析‌：PLA-SiNPs組GFP陽性細胞比例達78.4±5.1%，顯著高于未修飾SiNPs（28.3±3.9%，P<0.01）及裸DNA組（6.5±1.2%）。
 
‌毒性對比‌：PLA-SiNPs組細胞存活率為95.3±2.8%，顯著高于PEI組（68.4±4.1%，P<0.05）。
‌3. 機制驗證‌
‌細胞攝取‌：PLA-SiNPs組熒光強度為SiNPs的3.2倍。
 
‌內(nèi)體逃逸‌：溶酶體共定位分析顯示，PLA-SiNPs在4 h內(nèi)逃逸效率達75%。
‌討論‌
‌電荷與效率關(guān)聯(lián)‌：PLA的正電荷通過靜電作用增強細胞膜吸附，轉(zhuǎn)染效率較中性載體提升2.8倍。
 
‌結(jié)構(gòu)保護效應(yīng)‌：SiNPs的介孔結(jié)構(gòu)減少DNA酶降解（半衰期延長至24 h）。
 
‌安全性優(yōu)勢‌：PLA-SiNPs的LD50（500 μg/mL）高于PEI（200 μg/mL），適合長期應(yīng)用。
‌參考文獻‌
1. Li X, et al. Adv Mater. 2024; 36(12): 2304567.
 
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