cfWGBS揭示與年齡和肌萎縮側索硬化相關cfDNA甲基化變化及組織
游離細胞DNA (Cell-free DNA，cfDNA)是血漿中游離的DNA片段，通常來源于正常細胞更新或病理狀態(tài)下的細胞死亡。cfDNA已被廣泛應用于癌癥早期檢測、胎兒遺傳病診斷、器官移植評估等領域。然而，cfDNA在神經退行性疾病（如肌萎縮側索硬化）中的應用仍處于探索階段。肌萎縮側索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis ，ALS）是一種主要影響運動神經元的神經退行性疾病，導致肌肉無力、癱瘓，最終可能因呼吸衰竭而死亡。ALS診斷存在延遲，因為早期癥狀不特異，且缺乏可靠的生物標志物。
DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，能夠影響基因表達，且具有組織和細胞特異性。在ALS患者中，中樞神經系統(tǒng)（CNS）組織和全血中已發(fā)現異常的DNA甲基化模式，但cfDNA甲基化組尚未被充分研究。
近日，埃默里大學醫(yī)學院人類遺傳學系Peng Jin團隊在《Cell & Bioscience》雜志發(fā)表題為《Whole-genome bisulfite sequencing of cell-free DNA unveils age-dependent and ALS-associated methylation alterations》的研究論文，研究通過全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS），分析了血漿中的cfDNA甲基化模式，揭示了與年齡相關以及ALS相關的甲基化變化。并分析了cfDNA甲基化與ALS患者中樞神經系統(tǒng)基因表達之間的相關性。最后評估了cfDNA甲基化作為ALS生物標志物的潛力。
血漿中的cfDNA攜帶了其起源組織或細胞特異性的表觀遺傳學特征。循環(huán)cfDNA中異常的甲基化模式已成為非侵入性癌癥檢測、產前診斷和器官移植評估的有力工具。這些表觀遺傳學變化在診斷進展緩慢且具有長期無癥狀期的神經退行性疾病方面也顯示出巨大潛力。然而，神經退行性疾病中cfDNA的全基因組甲基化變化尚未得到充分研究。
本研究通過對包括年輕和中年對照組以及與對照組匹配的ALS患者共30名個體的cfDNA進行全基因組亞硫酸鹽測序（cfWGBS），分析了與年齡相關和ALS相關的甲基化特征。研究共鑒定出5223個與年齡相關的差異甲基化位點（DML），其中51.6%在老年個體中表現為低甲基化。本研究結果與一項大規(guī)�；谘旱谋碛^基因組關聯研究（EWAS）中鑒定的與年齡相關CpG位點有顯著重疊。在ALS患者與對照組的比較中，共檢測到1045個差異甲基化區(qū)域（DMRs），這些DMRs位于基因體（genebody）、啟動子和基因間區(qū)域，且這些DMRs與ALS的關鍵相關通路（包括內吞作用和細胞黏附）相關。與脊髓轉錄組學數據整合分析顯示，31%的DMR相關基因在ALS患者中表現出與對照組差異表達，其中超20個基因與疾病持續(xù)時間顯著相關。此外，與已發(fā)表的ALS單核RNA測序（snRNA-Seq）數據比較表明，cfDNA甲基化變化揭示了ALS患者大腦中細胞類型特異性的基因失調，特別是在興奮性神經元和星形膠質細胞中。cfDNA甲基化譜反卷積分析（deconvolution analysis）還提示ALS患者中免疫細胞和肝臟來源的cfDNA比例發(fā)生變化。
本研究結果表明，cfDNA甲基化是一種強大的工具，能夠通過揭示受擾動的位點、基因以及不同組織/細胞對血漿的貢獻比例，評估與年齡相關的改變和ALS特異性的分子失調。這種技術有望在廣泛的神經退行性疾病中用于生物標志物發(fā)現的臨床應用。
研究方法
樣本收集：研究共納入30名受試者，包括年輕和中年對照組，以及ALS患者和匹配的對照組。血漿樣本通過非侵入性血液采樣獲得，cfDNA從血漿中提取。
cfWGBS測序：cfWGBS技術對cfDNA進行全基因組甲基化分析。該技術通過亞硫酸鹽處理將未甲基化的胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U），從而能夠精確檢測甲基化位點。
數據分析：比較年輕和中年對照組之間的甲基化差異，鑒定與年齡相關的差異甲基化位點。比較ALS患者和對照組之間的甲基化差異，識別差異甲基化區(qū)域。將cfDNA甲基化數據與脊髓轉錄組數據整合，分析ALS患者中基因表達變化。利用snRNA-Seq數據，分析cfDNA甲基化變化是否揭示ALS患者大腦中細胞類型特異性的基因調控。
組織/細胞溯源：通過反卷積分析，利用cfDNA的甲基化特征估計其組織和細胞來源。
結果圖形
（1）cfDNA 中年齡相關的甲基化變化
研究發(fā)現5223個與年齡相關的差異甲基化位點，其中51.6%在老年個體中表現出低甲基化。這些位點與肌肉細胞的細胞骨架組織、軸突導向和鈣信號通路相關。與大規(guī)模血液樣本EWAS結果相比，研究中鑒定的差異甲基化位點與EWAS中鑒定的CpG位點有顯著重疊。
圖1：利用血漿來源的 cfDNA 全基因組甲基化分析來鑒定年齡相關和ALS相關甲基化特征的研究工作流程
圖2：鑒定 cfDNA 中與年齡相關的甲基化特征。
A.年輕和中年群體平均全基因組 mCG 水平條形圖。組間未觀察到甲基化水平的顯著差異。
B. 兩組之間 DML 的鑒定。
C. 兩組之間鑒定的 DMLs 甲基化譜熱圖。
D. 已鑒定的 DML 的基因組注釋到它們在每個基因組特征中的百分比。
E. DML 相關基因的 KEGG 分析以分析其生物學意義
（2）cfDNA中ALS相關的甲基化變化
在ALS患者和對照組之間鑒定出1045個DMRs，其中564個表現為低甲基化，481個表現為高甲基化。這些DMRs主要位于基因體、啟動子和基因間區(qū)域，且與內吞作用和細胞黏附通路相關。與ALS相關的DMRs中，約21%位于CpG島內。
（3）cfDNA甲基化與基因表達的相關性
將ALS相關的DMRs與脊髓轉錄組數據整合，發(fā)現31%的DMR相關基因在ALS患者中表現出差異表達。進一步分析發(fā)現，與ALS進展相關的基因中，ARRB2和CYBA的表達水平與疾病持續(xù)時間顯著相關。
B. 小提琴圖顯示與對照組相比，ALS患者脊髓中cfDNA差異甲基化的DEGs的log2倍數變化（LFC）。
C-D. 頸段和腰段脊髓中重疊基因的KEGG通路分析。
E. 維恩圖展示與ALS疾病持續(xù)時間相關的基因與DMR相關基因之間的重疊。
F. 注釋到ARRB2和CYBA的DMRs的詳細信息，以及它們在脊髓中的基因表達統(tǒng)計信息。
（4）cfDNA甲基化揭示 ALS 中的細胞特異性基因調控
利用snRNA-Seq數據，研究發(fā)現cfDNA甲基化變化與ALS患者大腦中興奮性神經元和星形膠質細胞的基因表達失調密切相關。在這些細胞類型中，DMR相關基因的差異表達比例較高，表明cfDNA甲基化可能反映細胞類型特異性的基因調控。
B. 分別顯示額葉皮層（左）和運動皮層（右）中六種主要細胞類型中與DMR相關基因重疊的DEGs數量。
C. 條形圖顯示每種細胞類型中與cfDNA中的DMR相關的DEGs的百分比。
D. 對重疊基因的DMR進行基因組注釋，顯示其在每種基因組特征中的百分比。
E. 箱線圖顯示在額葉皮層（左）和運動皮層（右）中，每種主要細胞類型中cfDNA差異甲基化的DEGs的LogFC。
F-G. KEGG通路分析揭示重疊基因在ALS額葉皮層（左）和運動皮層（右）中的功能意義。
（5）cfDNA甲基化的組織/細胞溯源
反卷積分析顯示，ALS患者中T細胞和B細胞來源的cfDNA比例降低，而肝臟來源的cfDNA比例增加。
圖6：基于WGBS數據的14種組織比例分析箱線圖（使用I型和II型甲基化標記）。
ALS患者與對照組相比，來自T細胞和B細胞的cfDNA比例顯著降低，而來自肝臟的cfDNA比例增加。
易小結
本研究通過cfWGBS技術揭示了cfDNA中與年齡和ALS相關的甲基化變化，并展示了cfDNA甲基化在反映ALS患者中樞神經系統(tǒng)基因表達失調方面的潛力。研究結果為cfDNA作為ALS生物標志物的應用提供了有力支持，并為未來的研究和臨床應用奠定了基礎。
參考文獻：
Jin Y, Conneely KN, Ma W, Naviaux RK, Siddique T, Allen EG, Guingrich S, Pascuzzi RM, Jin P. Whole-genome bisulfite sequencing of cell-free DNA unveils age-dependent and ALS-associated methylation alterations. Cell Biosci. 2025 Feb 20;15(1):26. pii: 10.1186/s13578-025-01366-1. doi: 10.1186/s13578-025-01366-1.
DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，能夠影響基因表達，且具有組織和細胞特異性。在ALS患者中，中樞神經系統(tǒng)（CNS）組織和全血中已發(fā)現異常的DNA甲基化模式，但cfDNA甲基化組尚未被充分研究。
近日，埃默里大學醫(yī)學院人類遺傳學系Peng Jin團隊在《Cell & Bioscience》雜志發(fā)表題為《Whole-genome bisulfite sequencing of cell-free DNA unveils age-dependent and ALS-associated methylation alterations》的研究論文，研究通過全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS），分析了血漿中的cfDNA甲基化模式，揭示了與年齡相關以及ALS相關的甲基化變化。并分析了cfDNA甲基化與ALS患者中樞神經系統(tǒng)基因表達之間的相關性。最后評估了cfDNA甲基化作為ALS生物標志物的潛力。
血漿中的cfDNA攜帶了其起源組織或細胞特異性的表觀遺傳學特征。循環(huán)cfDNA中異常的甲基化模式已成為非侵入性癌癥檢測、產前診斷和器官移植評估的有力工具。這些表觀遺傳學變化在診斷進展緩慢且具有長期無癥狀期的神經退行性疾病方面也顯示出巨大潛力。然而，神經退行性疾病中cfDNA的全基因組甲基化變化尚未得到充分研究。
本研究通過對包括年輕和中年對照組以及與對照組匹配的ALS患者共30名個體的cfDNA進行全基因組亞硫酸鹽測序（cfWGBS），分析了與年齡相關和ALS相關的甲基化特征。研究共鑒定出5223個與年齡相關的差異甲基化位點（DML），其中51.6%在老年個體中表現為低甲基化。本研究結果與一項大規(guī)�；谘旱谋碛^基因組關聯研究（EWAS）中鑒定的與年齡相關CpG位點有顯著重疊。在ALS患者與對照組的比較中，共檢測到1045個差異甲基化區(qū)域（DMRs），這些DMRs位于基因體（genebody）、啟動子和基因間區(qū)域，且這些DMRs與ALS的關鍵相關通路（包括內吞作用和細胞黏附）相關。與脊髓轉錄組學數據整合分析顯示，31%的DMR相關基因在ALS患者中表現出與對照組差異表達，其中超20個基因與疾病持續(xù)時間顯著相關。此外，與已發(fā)表的ALS單核RNA測序（snRNA-Seq）數據比較表明，cfDNA甲基化變化揭示了ALS患者大腦中細胞類型特異性的基因失調，特別是在興奮性神經元和星形膠質細胞中。cfDNA甲基化譜反卷積分析（deconvolution analysis）還提示ALS患者中免疫細胞和肝臟來源的cfDNA比例發(fā)生變化。
本研究結果表明，cfDNA甲基化是一種強大的工具，能夠通過揭示受擾動的位點、基因以及不同組織/細胞對血漿的貢獻比例，評估與年齡相關的改變和ALS特異性的分子失調。這種技術有望在廣泛的神經退行性疾病中用于生物標志物發(fā)現的臨床應用。
研究方法
樣本收集：研究共納入30名受試者，包括年輕和中年對照組，以及ALS患者和匹配的對照組。血漿樣本通過非侵入性血液采樣獲得，cfDNA從血漿中提取。
cfWGBS測序：cfWGBS技術對cfDNA進行全基因組甲基化分析。該技術通過亞硫酸鹽處理將未甲基化的胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U），從而能夠精確檢測甲基化位點。
數據分析：比較年輕和中年對照組之間的甲基化差異，鑒定與年齡相關的差異甲基化位點。比較ALS患者和對照組之間的甲基化差異，識別差異甲基化區(qū)域。將cfDNA甲基化數據與脊髓轉錄組數據整合，分析ALS患者中基因表達變化。利用snRNA-Seq數據，分析cfDNA甲基化變化是否揭示ALS患者大腦中細胞類型特異性的基因調控。
組織/細胞溯源：通過反卷積分析，利用cfDNA的甲基化特征估計其組織和細胞來源。
結果圖形
（1）cfDNA 中年齡相關的甲基化變化
研究發(fā)現5223個與年齡相關的差異甲基化位點，其中51.6%在老年個體中表現出低甲基化。這些位點與肌肉細胞的細胞骨架組織、軸突導向和鈣信號通路相關。與大規(guī)模血液樣本EWAS結果相比，研究中鑒定的差異甲基化位點與EWAS中鑒定的CpG位點有顯著重疊。
圖2：鑒定 cfDNA 中與年齡相關的甲基化特征。
B. 兩組之間 DML 的鑒定。
C. 兩組之間鑒定的 DMLs 甲基化譜熱圖。
D. 已鑒定的 DML 的基因組注釋到它們在每個基因組特征中的百分比。
E. DML 相關基因的 KEGG 分析以分析其生物學意義
表1：cfDNA和血液樣本之間共有 CpG 位點方向的一致性
（2）cfDNA中ALS相關的甲基化變化
在ALS患者和對照組之間鑒定出1045個DMRs，其中564個表現為低甲基化，481個表現為高甲基化。這些DMRs主要位于基因體、啟動子和基因間區(qū)域，且與內吞作用和細胞黏附通路相關。與ALS相關的DMRs中，約21%位于CpG島內。
圖3：ALS中cfDNA甲基化圖譜特征。
- 條形圖顯示ALS組和對照組的全基因組mCG（甲基化胞嘧啶）平均水平。兩組之間的甲基化水平未觀察到顯著差異。
- Metagene圖顯示在轉錄起始位點（TSS）、轉錄終止位點（TES）和RefSeq基因體的mCG（上）水平。
- ALS組和對照組之間的DMRs（上），并用熱圖（下）可視化所鑒定DMRs的甲基化譜。
- 對鑒定的DMRs進行基因組注釋，顯示其在每種基因組特征中的百分比。
- ALS相關DMRs在CpG島（CGIs）、CpG架、CpG岸和其他基因組區(qū)域內的比例。
- 上：高甲基化DMRs和低甲基化DMRs在每種基因組特征中的百分比。下：DMRs相對于基因組背景的富集倍數。
- 對DMRs相關基因進行GO和KEGG通路分析，以探索其與ALS的功能相關性。
（3）cfDNA甲基化與基因表達的相關性
將ALS相關的DMRs與脊髓轉錄組數據整合，發(fā)現31%的DMR相關基因在ALS患者中表現出差異表達。進一步分析發(fā)現，與ALS進展相關的基因中，ARRB2和CYBA的表達水平與疾病持續(xù)時間顯著相關。
圖4：ALS中cfDNA甲基化與脊髓基因表達的整合分析
A. 維恩圖展示cfDNA中DMR相關基因與ALS患者三個脊髓節(jié)段中鑒定的差異表達基因（DEGs）之間的重疊。B. 小提琴圖顯示與對照組相比，ALS患者脊髓中cfDNA差異甲基化的DEGs的log2倍數變化（LFC）。
C-D. 頸段和腰段脊髓中重疊基因的KEGG通路分析。
E. 維恩圖展示與ALS疾病持續(xù)時間相關的基因與DMR相關基因之間的重疊。
F. 注釋到ARRB2和CYBA的DMRs的詳細信息，以及它們在脊髓中的基因表達統(tǒng)計信息。
（4）cfDNA甲基化揭示 ALS 中的細胞特異性基因調控
利用snRNA-Seq數據，研究發(fā)現cfDNA甲基化變化與ALS患者大腦中興奮性神經元和星形膠質細胞的基因表達失調密切相關。在這些細胞類型中，DMR相關基因的差異表達比例較高，表明cfDNA甲基化可能反映細胞類型特異性的基因調控。
圖5：ALS中cfDNA甲基化與snRNA-Seq數據的整合分析（靶向額葉皮層和運動皮層）
A. 維恩圖顯示cfDNA甲基化DMR相關基因與ALS患者額葉皮層和運動皮層中鑒定的DEGs之間的重疊（與對照組相比）。B. 分別顯示額葉皮層（左）和運動皮層（右）中六種主要細胞類型中與DMR相關基因重疊的DEGs數量。
C. 條形圖顯示每種細胞類型中與cfDNA中的DMR相關的DEGs的百分比。
D. 對重疊基因的DMR進行基因組注釋，顯示其在每種基因組特征中的百分比。
E. 箱線圖顯示在額葉皮層（左）和運動皮層（右）中，每種主要細胞類型中cfDNA差異甲基化的DEGs的LogFC。
F-G. KEGG通路分析揭示重疊基因在ALS額葉皮層（左）和運動皮層（右）中的功能意義。
（5）cfDNA甲基化的組織/細胞溯源
反卷積分析顯示，ALS患者中T細胞和B細胞來源的cfDNA比例降低，而肝臟來源的cfDNA比例增加。
圖6：基于WGBS數據的14種組織比例分析箱線圖（使用I型和II型甲基化標記）。
易小結
本研究通過cfWGBS技術揭示了cfDNA中與年齡和ALS相關的甲基化變化，并展示了cfDNA甲基化在反映ALS患者中樞神經系統(tǒng)基因表達失調方面的潛力。研究結果為cfDNA作為ALS生物標志物的應用提供了有力支持，并為未來的研究和臨床應用奠定了基礎。
參考文獻：
Jin Y, Conneely KN, Ma W, Naviaux RK, Siddique T, Allen EG, Guingrich S, Pascuzzi RM, Jin P. Whole-genome bisulfite sequencing of cell-free DNA unveils age-dependent and ALS-associated methylation alterations. Cell Biosci. 2025 Feb 20;15(1):26. pii: 10.1186/s13578-025-01366-1. doi: 10.1186/s13578-025-01366-1.
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