用戶文章：食品加工使半夏中毒性凝集素減少和生物活性肽增加
天南星科植物多含毒，后期加工可顯著減少毒性，半夏（Pinellia ternata tuber，PTT）便是其中之一。它具有多種藥用活性，其祛濕化痰功效可能與降壓有關(guān)，但活性成分和作用機(jī)制不明。2024年10月，澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的李娜副教授和伍建林副教授團(tuán)隊(duì)在Current Research in Food Science 期刊發(fā)表了題為“Food processing drives the toxic lectin reduction and bioactive peptide enhancement in Pinellia ternata” 的研究成果，該研究通過整合多種技術(shù)，探究了加工后的半夏（Processed Pinellia ternata tuber，PPTT）中有毒凝集素減少和生物活性肽增加的機(jī)制，為其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的加工和應(yīng)用提供依據(jù)（實(shí)驗(yàn)流程示意圖見圖1）。其中，活性肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析使用PEAKS® Studio完成。
圖1 PTT加工后生物活性肽鑒定的工作流程
PPTT樣本制備
在天南星科中，大多數(shù)物種會(huì)產(chǎn)生針狀草酸鈣晶體（NCOCs）和凝集素蛋白，從而引起黏膜刺激性毒性，一般需要對(duì)原材料加工以減輕毒性之后才可使用。本研究對(duì)不同批次的半夏塊莖進(jìn)行加工，以研究該過程中成分的動(dòng)態(tài)變化。圖2A顯示，處理1天后，NCOCs的水平迅速下降，隨后在2至10天內(nèi)逐漸下降，最終在處理的第7至10天達(dá)到與商業(yè)化PPTT相當(dāng)?shù)乃�。此外，在處�?天后觀察到凝集素（圖2B）顯著減少，隨后在1至5天內(nèi)逐漸減少，達(dá)到與商業(yè)化PPTT相似的水平，并且當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至10天時(shí)幾乎保持不變。以上結(jié)果表明，7至9天是PTT的最佳處理時(shí)間。
圖2 PPTT制備工藝比較PPTT成分的FBMN分析
LC-MS可以提供分子的精確的質(zhì)荷比和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，而GNPS中的基于特征的分子網(wǎng)絡(luò)（FBMN）分析可用于探索和注釋復(fù)雜的分子數(shù)據(jù)集[1]。本研究應(yīng)用FBMN快速發(fā)現(xiàn)和表征PTT中的分子成分。
首先優(yōu)化LC-MS實(shí)驗(yàn)方法，采集到質(zhì)譜譜圖后，使用MS-DIAL處理數(shù)據(jù)，并將得到的分子量列表上傳到GNPS在線工作流以創(chuàng)建分子網(wǎng)絡(luò)。共發(fā)現(xiàn)了1954個(gè)質(zhì)譜節(jié)點(diǎn)，注釋涵蓋7個(gè)化學(xué)類別，包括多肽、氨基酸、胺、生物堿、有機(jī)酸、脂質(zhì)和多胺（圖3A）。其中，130個(gè)特殊節(jié)點(diǎn)被FBMN標(biāo)記為多肽（圖3A），這在PTT中鮮有報(bào)道。此外，作者研究了PTT和PPTT中每種肽的豐度和比例（圖3C），這些結(jié)果揭示了大多數(shù)肽的水平在加工后顯著增加。最重要的是，130個(gè)肽的總含量逐漸增加，并在加工第9天時(shí)達(dá)到最高（圖3D）。據(jù)報(bào)道，多肽具有各種活性，一些食物的真正功效可能來自其生物活性肽，因此推測(cè)這些增加的多肽可能與PTT生物活性的增強(qiáng)有關(guān)。隨后，對(duì)這些肽的結(jié)構(gòu)和生物活性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
首先優(yōu)化LC-MS實(shí)驗(yàn)方法，采集到質(zhì)譜譜圖后，使用MS-DIAL處理數(shù)據(jù)，并將得到的分子量列表上傳到GNPS在線工作流以創(chuàng)建分子網(wǎng)絡(luò)。共發(fā)現(xiàn)了1954個(gè)質(zhì)譜節(jié)點(diǎn)，注釋涵蓋7個(gè)化學(xué)類別，包括多肽、氨基酸、胺、生物堿、有機(jī)酸、脂質(zhì)和多胺（圖3A）。其中，130個(gè)特殊節(jié)點(diǎn)被FBMN標(biāo)記為多肽（圖3A），這在PTT中鮮有報(bào)道。此外，作者研究了PTT和PPTT中每種肽的豐度和比例（圖3C），這些結(jié)果揭示了大多數(shù)肽的水平在加工后顯著增加。最重要的是，130個(gè)肽的總含量逐漸增加，并在加工第9天時(shí)達(dá)到最高（圖3D）。據(jù)報(bào)道，多肽具有各種活性，一些食物的真正功效可能來自其生物活性肽，因此推測(cè)這些增加的多肽可能與PTT生物活性的增強(qiáng)有關(guān)。隨后，對(duì)這些肽的結(jié)構(gòu)和生物活性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
圖3 PPTT中的分子特征網(wǎng)絡(luò)分析PPTT多肽鑒定
盡管FBMN方法加速了肽的發(fā)現(xiàn)，但GNPS庫(kù)中匹配到的多肽有限（圖3B），仍需根據(jù)質(zhì)譜譜圖解析更多新的多肽序列。PEAKS®軟件將從頭測(cè)序和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索技術(shù)相結(jié)合，可以靈敏、準(zhǔn)確地解析樣本中的潛在多肽[2]。通過FBMN、PEAKS從頭測(cè)序和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索相結(jié)合的方法，成功解析了130個(gè)特殊節(jié)點(diǎn)的氨基酸序列（圖4A）。由于CID無法區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸的異構(gòu)體，作者根據(jù)抑制劑參考蛋白庫(kù)進(jìn)行校驗(yàn)。這130種肽段長(zhǎng)度從2到10不等（圖4B），其中98條首次被定義為凝集素衍生肽。為了全面了解處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)多肽生成的影響，作者還對(duì)PPTT中130個(gè)多肽加工1-10天后的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。大多數(shù)肽的含量隨著加工時(shí)間的增加而增加，并且大多數(shù)肽在7~9天達(dá)到最高水平。加工有利于產(chǎn)生更多的肽，但較長(zhǎng)的處理時(shí)間導(dǎo)致長(zhǎng)肽比例下降。（圖4C）
圖4 PPTT中鑒定到的多肽PTT中具有降壓活性的肽段篩選
經(jīng)過對(duì)潛在的130條多肽綜合分析發(fā)現(xiàn)，Pro (P)、Phe(F)、Val (V)和Leu (L)在N端和C端高頻出現(xiàn)，據(jù)報(bào)道此類多肽很可能具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE）抑制活性。因此作者進(jìn)一步進(jìn)行了相應(yīng)研究。首先，通過pLM4ACE[3]篩選出40條具有抗高血壓活性的肽段（圖5A），然后選擇了5條代表性多肽（MLFSG, LFSGQVL,MLFSGQVL, VIYGPSVF, and VVHPEGRL）進(jìn)行人工合成（圖5B-F）。隨后的抑制活性實(shí)驗(yàn)表明，VIYGPSVF和MLFSG在0.27和0.53 mg/mL的濃度下表現(xiàn)出較高的ACE抑制率，分別為69.51%和80.43%。其次是MLFSGQVL、LFSGQVL和VVHPEGRL，它們?cè)?.33 mg/mL的濃度下的ACE抑制率分別為72.21%、71.36%和53.34%（圖5G）。
圖5 抗高血壓活性測(cè)定據(jù)報(bào)道，ACE抑制活性（IC50）值范圍在0.32-1000 μM范圍內(nèi)的多肽均具有降低血壓的潛力。因此作者在131、185、603、647和1140μM下，分別測(cè)定了每種肽的IC50，結(jié)果與前述一致（圖 5H，表 1）。因此，這5種凝集素衍生的肽，尤其是 VIYGPSVF 和 MLFSG，很有可能就是PPTT中的抗高血壓活性肽的主要成分。
表1 五種凝集素衍生肽的IC50測(cè)定結(jié)果
ACE活性抑制機(jī)制
為了進(jìn)一步闡明 ACE 抑制的機(jī)制，作者對(duì)上述5條多肽進(jìn)行了計(jì)算機(jī)分子對(duì)接。結(jié)果表明，所有肽段都與ACE發(fā)生有效相互作用（圖6）。
圖6 ACE分子對(duì)接結(jié)果市售PPTT中生物活性肽的鑒定
為了全面驗(yàn)證PPTT中5種生物活性肽的廣泛適用性，作者分析了來自10批不同的市售PTT樣本。LC-MS分析發(fā)現(xiàn)所有批次的樣品都含有以上5種多肽（圖7），表明這些活性肽適用于常見的PTT產(chǎn)品。這些發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步探索PTT等天南星科樣本的功能性多肽。
圖7 市售PPTT活性肽檢測(cè)
小結(jié)
本研究基于 LC-MS、FBMN、從頭測(cè)序、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和生物活性研究的綜合方法，揭示了半夏加工減毒增效機(jī)制，發(fā)現(xiàn)加工可減少有毒凝集素，促進(jìn)生物活性肽生成，7-9天為最佳加工時(shí)間，且商業(yè)化PPTT產(chǎn)品中廣泛存在潛在降壓肽，為天南星科其他材料的深入研究提供了參考。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.crfs.2024.100895
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