使用WMicrotracker完成秀麗隱桿線蟲發(fā)育毒性評估

發(fā)育毒性測試是為了評估化學(xué)物質(zhì)對人類發(fā)育的潛在不良影響。發(fā)育毒性包括從受孕前到產(chǎn)前、產(chǎn)后發(fā)育以及性成熟過程中發(fā)生的各種不良影響。目前有多種批準(zhǔn)的測試指南用于評估哺乳動物發(fā)育毒性的不同方面，但這些測試都很昂貴、耗時且涉及動物福利問題。從線蟲到人類，許多與胚胎和幼兒發(fā)育關(guān)鍵的基本途徑和過程在基因上是保守的。由于有機(jī)體發(fā)育的復(fù)雜性，通過體外評估毒物對所有可能的發(fā)育靶點的影響是具有挑戰(zhàn)性的，但也為小型非哺乳動物模型動物在替代發(fā)育毒性測試中發(fā)揮作用提供了機(jī)會。將毒性測試使用小型模型生物（如秀麗隱桿線蟲）添加到人類細(xì)胞體外測試中，可以增加細(xì)胞和組織復(fù)雜性水平，模擬較晚的發(fā)育過程，評估無法完全模擬使用當(dāng)前體外微生理系統(tǒng)的有機(jī)體生長速率和行為等頂/-級終點。發(fā)育毒性的四個主要表現(xiàn)是生長速度改變、功能缺陷、結(jié)構(gòu)異常和死亡。生長遲緩是常用的監(jiān)管目的的終點，暴露于毒物后體重減輕可能表明其他發(fā)育終點的變化。

小型模式生物如秀麗隱桿線蟲被用于進(jìn)行發(fā)育毒性測試有以下優(yōu)勢：
1. 遺傳途徑的保守性：秀麗隱桿線蟲與人類之間存在許多遺傳途徑的保守性，包括與器官發(fā)育、神經(jīng)功能、對毒性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)以及疾病過程相關(guān)的途徑。這意味著通過對秀麗隱桿線蟲進(jìn)行發(fā)育毒性測試，可以獲得對人類發(fā)育的一些重要方面的信息。
2. 發(fā)育過程的建模：秀麗隱桿線蟲從孵化到產(chǎn)卵成蟲只需要3天，這使得它們的發(fā)育過程相對較短，可以更快地獲得發(fā)育毒性的結(jié)果。此外，秀麗隱桿線蟲的發(fā)育過程在某些方面與哺乳動物類似，因此可以用作預(yù)測口服毒性測試的模型。
3. 組織和細(xì)胞復(fù)雜性的增加：相對于體外細(xì)胞試驗，使用秀麗隱桿線蟲等小型模式生物可以提供更高級別的細(xì)胞和組織復(fù)雜性。這對于評估發(fā)育過程中的各種不同方面是非常重要的。
4. 評估整體發(fā)育終點：秀麗隱桿線蟲等小型模式生物可以評估整體發(fā)育終點，如生長速率和行為等，這些是目前的體外微生理系統(tǒng)無法完全模擬的。綜上所述，使用小型模式生物如秀麗隱桿線蟲進(jìn)行發(fā)育毒性。

線蟲的發(fā)展和活動測試（wDAT）測量了線蟲的發(fā)育里程碑獲得時間和特定階段的自發(fā)運(yùn)動活動（SLA）。此前，wDAT確定了哺乳動物發(fā)育毒物砷、鉛和汞對C. clegans的發(fā)育遲緩和SLA水平的影響。5-氟尿嘧啶（5FU）、環(huán)磷酰胺（CP）、羥基脲（HU）和利巴韋林（RV）是致畸物，也會導(dǎo)致發(fā)育中的哺乳動物生長遲緩。至少在對這些化學(xué)物質(zhì)中的每一種進(jìn)行的一些研究中，在哺乳動物接觸這些化學(xué)物質(zhì)時，胎兒體重的減輕程度低于那些具有致畸作用的化學(xué)物質(zhì)，這表明在一個小的替代全動物模型中篩選發(fā)育遲緩可以作為一個一般的毒性終點，以確定化學(xué)物質(zhì)，以便進(jìn)一步測試更具體的不良發(fā)育結(jié)果。與哺乳動物的發(fā)育影響一致，5FU、HU和RV與wDAT的發(fā)育遲緩有關(guān)。與發(fā)育遲緩相關(guān)的暴露導(dǎo)致5FU和HU的低活動，但RV的輕度多活動。CP是一種前藥，需要細(xì)胞色素p450的生物活化才能產(chǎn)生治療和毒性作用。在一些體外試驗中，CP測試為假陰性，并且在wDAT中也是假陰性。這些結(jié)果表明，wDAT有可能識別出一些發(fā)育毒性物質(zhì)，并且未知的wDAT陽性結(jié)果可能需要在哺乳動物中進(jìn)一步測試。采用更大的陽性和陰性對照組進(jìn)行進(jìn)一步評估，將有助于確定秀麗隱桿線蟲wDAT測定法在毒性測試電池或發(fā)育毒性評估證據(jù)權(quán)重方法中的適用性和實用性。沒有一種測試方法可以完全模擬毒性對人類發(fā)育的影響，相反整合和翻譯來自各種模型和來源的數(shù)據(jù)被認(rèn)為是最有效的。

為了進(jìn)行完整的研究，在同一WMicrotracker設(shè)備中重復(fù)了四次wDAT，改變了對角線給藥模式，以便在研究中每種條件下每個孔僅使用一次，以考慮傳感器放置和孔在跟蹤器內(nèi)的對齊方面的細(xì)微差異。

每個wDAT 實驗包括兩個12 孔板中的每個板的一個水對照組和三個暴露條件，在并排的WMicrotracker中進(jìn)行評估，持續(xù)3 天，每種暴露條件在3 個孔中重復(fù)。在WMicrotracker運(yùn)行軟件中選擇了30 分鐘的增量時間。原始WMicrotracker輸出數(shù)據(jù)的Excel 文件包含在補(bǔ)充材料中。為避免峰值時間基于噪聲的選擇，在每個時間點使用連續(xù)七次讀數(shù)的平均值對所得曲線進(jìn)行平滑處理。報告的值為相對于匹配對照的相對值，包括達(dá)到峰值的時間和峰值高度。使用學(xué)生t 檢驗值來計算統(tǒng)計學(xué)意義，并如前所述（Hunt 等人，2018 年），將具有生物學(xué)意義的最小變化設(shè)定為≥for發(fā)育時間點和≥10%的自主運(yùn)動活動變化。wDAT 僅量化這兩個終點，但在測試結(jié)束時，會記錄對顯微鏡觀察到的培養(yǎng)基外觀和暴露組形態(tài)的注釋。雖然wDAT 本身并不評估死亡率，但在超出范圍發(fā)現(xiàn)實驗的濃度下評估時，未發(fā)現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

蠕蟲發(fā)育與活動測試（wDAT）是一種快速毒性測試，使用相對廉價的平臺。在本研究中，對wDAT 檢測具有已知發(fā)育影響的可溶性化學(xué)物質(zhì)的能力進(jìn)行了評估。在研究結(jié)束時揭開盲法，發(fā)現(xiàn)四種盲法化學(xué)物質(zhì)是畸胎原，在嚙齒動物中，母體暴露時還會降低胎兒體重，而其中一種常用于發(fā)育研究中的陰性對照。5-氟尿嘧啶、尿素和利巴韋林會改變秀麗隱桿線蟲的發(fā)育時間表和特定階段的自發(fā)運(yùn)動活動。前藥環(huán)磷酰胺在wDAT 中呈假陰性。D-甘露醇在wDAT 中也沒有效果。wDAT 正確識別了四個陽性對照中的三個以及陰性對照。因此，wDAT 有可能有助于發(fā)育毒性的證據(jù)權(quán)重評估；然而，還需要進(jìn)行更多的測試來確定其在監(jiān)管背景下的適用用途。
 

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