利用單細(xì)胞、空間和原位綜合分析技術(shù)繪制腫瘤微環(huán)境高分辨率圖譜

圖 1

主要技術(shù)
scRNA-seq、Visium、Xenium

研究結(jié)果
1. 人乳腺癌FFPE組織進(jìn)行綜合繪圖
對(duì)乳腺癌FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(scFFPE-seq)，從乳腺癌組織中生成了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析獲得17個(gè)群(圖2a)。通過(guò)收集與用于scFFPE-seq的組織切片相鄰的5μm組織切片來(lái)生成Visium轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同樣獲得了17個(gè)群(圖2b)。通過(guò)marker基因?qū)�scFFPE-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，并將細(xì)胞類型映射到Visium數(shù)據(jù)上，其中十群注釋成具體細(xì)胞類型或疾病狀態(tài)，而其他七個(gè)群則由混合的細(xì)胞類型組成(圖2b)。通過(guò)Visium確定了三個(gè)腫瘤結(jié)構(gòu)域的空間位置，根據(jù)scFFPE-seq，這些腫瘤結(jié)構(gòu)域顯示為不同的集群，包括兩種分子上不同類型的導(dǎo)管原位癌DCIS#1、DCIS#2和浸潤(rùn)性腫瘤。Visium結(jié)果還得出免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的大致區(qū)域(圖2c)。
 

圖 2

2. Xenium原位數(shù)據(jù)在單細(xì)胞水平上揭示腫瘤異質(zhì)性
scFFPE-seq和Visium數(shù)據(jù)共同揭示了兩種不同的DCIS和肌上皮細(xì)胞類型，研究人員運(yùn)用Xenium技術(shù)以更詳細(xì)的細(xì)節(jié)和更高的分辨率探索這些區(qū)域的臨近細(xì)胞。Xenium 包含人類乳腺基因組(280個(gè)基因)和33個(gè)附加基因，共313個(gè)基因。對(duì)解碼一個(gè)周期后觀察RNA熒光圖像，以高分辨率顯示了組織的詳細(xì)結(jié)構(gòu)(圖3a)。對(duì)組織的進(jìn)一步分析能夠從penal中選擇相關(guān)基因，以鑒定基質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞等(圖3b)。還進(jìn)行 H＆E染色(圖3c)，以便能夠與病理學(xué)家的注釋交叉參考。通過(guò)軟件進(jìn)一步可視化細(xì)胞分割邊界(圖3d)，在分析的組織切片中，研究人員觀察到共167,885個(gè)細(xì)胞和36,944,521個(gè)轉(zhuǎn)錄本(Q值≥20)，每個(gè)細(xì)胞的中位轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為166(圖3e-f)。將scFFPE-seq數(shù)據(jù)下采樣至313個(gè)基因后，發(fā)現(xiàn)scFFPE-seq每個(gè)細(xì)胞的中位基因數(shù)為34，而Xenium數(shù)據(jù)為62(圖3g-h)。為驗(yàn)證Xenium人類乳腺癌面板的準(zhǔn)確性，研究人員將scFFPE-seq注釋轉(zhuǎn)移到Xenium數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)86%的細(xì)胞在Xenium數(shù)據(jù)中被明確識(shí)別為單一細(xì)胞類型(圖3i)。這一結(jié)果證實(shí)了Xenium能夠捕獲生物學(xué)異質(zhì)性。研究人員展示了基于Xenium數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型注釋結(jié)果，通過(guò)精確的轉(zhuǎn)錄本分配，識(shí)別出與單細(xì)胞數(shù)據(jù)相似的細(xì)胞類型，但是DCIS 亞型和增殖性腫瘤細(xì)胞沒(méi)有得到解決(圖3j-k)。這進(jìn)一步證明了Xenium技術(shù)在單細(xì)胞水平上的可靠性和準(zhǔn)確性。最后，研究人員生成了Xenium空間圖，直觀地展示了不同細(xì)胞類型在腫瘤微環(huán)境中的空間分布情況(圖3l)。
 

圖 3

3. 具有三種腫瘤亞型的乳腺癌樣本中細(xì)胞群體存在異質(zhì)性
研究人員首先利用scFFPE-seq數(shù)據(jù)將三種不同的腫瘤上皮細(xì)胞亞型和兩種肌上皮亞型映射到Xenium數(shù)據(jù)中，選擇了三個(gè)感興趣的區(qū)域(ROIs)：DCIS #1、DCIS #2和浸潤(rùn)性腫瘤區(qū)域進(jìn)行深入研究(圖4a)。使用scFFPE-seq數(shù)據(jù)確定了15種細(xì)胞類型在ROIs中的比例，包括淋巴細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)性細(xì)胞等。識(shí)別出四個(gè)主要的細(xì)胞類型組成差異：ACTA2+肌上皮細(xì)胞在DCIS #2 ROI中顯著存在，在DCIS #1 ROI中較少，在浸潤(rùn)性ROI中缺失，浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞在DCIS #2 ROI中存在，內(nèi)皮細(xì)胞在浸潤(rùn)性ROI中數(shù)量稍多(圖4b)。也進(jìn)一步驗(yàn)證了這些細(xì)胞類型組成差異，并展示了DCIS #2 ROI中ACTA2+肌上皮細(xì)胞的邊界環(huán)繞著浸潤(rùn)性細(xì)胞。這表明DCIS #2 ROI比DCIS #1 ROI更具侵襲性。浸潤(rùn)性ROI中浸潤(rùn)性細(xì)胞類型的發(fā)生率高，肌上皮細(xì)胞類型完全缺失。Xenium的高分辨率使得能夠捕獲鄰近細(xì)胞的信息(圖4c)。七種主要細(xì)胞類型的典型標(biāo)記物和腫瘤亞型之間差異表達(dá)基因的表達(dá)分析揭示了MZB1是DCIS #1 ROI的特異性標(biāo)記物，GJB2+基質(zhì)細(xì)胞在DCIS #2 ROI中存在，ALDH1A3、KRT15和KRT23：在DCIS #1 ROI的肌上皮細(xì)胞中高表達(dá)，MMP12為巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，在浸潤(rùn)性ROI中缺失(圖4d)。
 

圖 4

4. 整合空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和靶向原位數(shù)據(jù)描述了三陽(yáng)性區(qū)域
本研究使用的組織塊被標(biāo)注為HER2+/ER+/PR−。Xenium數(shù)據(jù)顯示，大部分區(qū)域?yàn)镋RBB2+(HER2+)和雙陽(yáng)性ERBB2+/ESR1+(HER2+/ER+)基因表達(dá)(圖5a)。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)了一個(gè)小的三陽(yáng)性ERBB2+/ESR1+/PGR+(HER2+/ER+/PR+)DCIS ROI，該區(qū)域位于脂肪細(xì)胞附近，主要由DCIS #2腫瘤上皮細(xì)胞組成，缺乏KRT15+肌上皮細(xì)胞層(圖5b-d)。接下來(lái)，研究人員比較了Xenium和scFFPE-seq數(shù)據(jù)中三種臨床上相關(guān)的受體基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在scFFPE-seq數(shù)據(jù)中，PGR+細(xì)胞很少，且這些細(xì)胞不共表達(dá)ESR1或ERBB2(圖5e-f)。在Visium數(shù)據(jù)中，三陽(yáng)性區(qū)域僅由5-6個(gè)點(diǎn)表示，作為Cluster 12的一部分。發(fā)現(xiàn)Visium數(shù)據(jù)能夠提供全轉(zhuǎn)錄組信息，揭示了三陽(yáng)性區(qū)域的基因表達(dá)特征(圖5g-h)。通過(guò)Xenium和Visium的數(shù)據(jù)，研究人員將Xenium中的轉(zhuǎn)錄本按鄰近關(guān)系分配到Visium點(diǎn)上，并對(duì)這五個(gè)點(diǎn)與其他惡性點(diǎn)進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析。識(shí)別出48個(gè)與PGR−DCIS #1相比的差異表達(dá)基因和44個(gè)與PGR−DCIS #2相比的差異表達(dá)基因(圖5i-j)。

圖 5

5. 整合單細(xì)胞和原位數(shù)據(jù)分析肌上皮邊界的細(xì)胞
為探索數(shù)據(jù)整合策略是否可以應(yīng)用于不同生物樣本中DCIS向浸潤(rùn)性過(guò)渡的研究。研究人員用不同的人乳腺癌切片進(jìn)行驗(yàn)證，該樣本被標(biāo)注為HER2+/ER−/PR−，包含正常、DCIS和浸潤(rùn)性區(qū)域。使用相同Xenium penal對(duì)樣本相同處理，識(shí)別了免疫細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞群體。在樣本中檢測(cè)到脂肪細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLA4+)、漿細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等。兩個(gè)基質(zhì)細(xì)胞群體分離成不同的簇，并且在空間上不同。對(duì)腫瘤、肌上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞群體進(jìn)行亞群分析，識(shí)別了增殖性(TOP2A+)、SCD+和S100A8+腫瘤細(xì)胞，以及M1、M2和CD83+巨噬細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)三種上皮細(xì)胞(ESR1+、PIGR+和OPRPN+)和一種肌上皮細(xì)胞(DST+)在分子和空間上都是不同的，與scRNA-seq參考數(shù)據(jù)一致。研究人員注意到一個(gè)位于腫瘤和肌上皮細(xì)胞群體之間的亞群，這些細(xì)胞共表達(dá)腫瘤(ERBB2、ABCC11)和肌上皮細(xì)胞(MYLK、DST)標(biāo)記物(圖6a)。并通過(guò)對(duì)DCIS區(qū)域的高倍鏡檢查，確認(rèn)這些細(xì)胞確實(shí)共表達(dá)這兩種標(biāo)記物(圖6b-c)。作為對(duì)照，研究人員觀察了正常導(dǎo)管區(qū)域，其中肌上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞緊密相鄰，但細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物沒(méi)有混合，這表明觀察結(jié)果不是由于粗略的分割錯(cuò)誤(圖6d)。接下來(lái)，研究人員對(duì)Xenium數(shù)據(jù)中識(shí)別的邊界細(xì)胞群體進(jìn)行了差異表達(dá)基因分析，并在樣本1的scFFPE-seq數(shù)據(jù)中尋找這種細(xì)胞類型特異性的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞中的大多數(shù)之前被注釋為肌上皮細(xì)胞，占scFFPE-seq數(shù)據(jù)中約1%的細(xì)胞。將這些細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞進(jìn)行比較，并推導(dǎo)出全轉(zhuǎn)錄組信息。這導(dǎo)致識(shí)別出在邊界細(xì)胞中高表達(dá)的基因CX3CL1、CCL28、PROM1等，這些基因在腫瘤細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞或任何其他共定位細(xì)胞類型中不表達(dá)(圖6e-f)。
 

圖 6

結(jié)語(yǔ)
本研究通過(guò)整合單細(xì)胞、空間和原位分析技術(shù)，對(duì)乳腺癌組織微環(huán)境進(jìn)行了高分辨率的基因表達(dá)分析，揭示了腫瘤異質(zhì)性和關(guān)鍵細(xì)胞類型的分子特征。研究使用了兩個(gè)FFPE乳腺癌組織塊，通過(guò)scFFPE-seq、Visium和Xenium技術(shù)，識(shí)別了不同的腫瘤亞型和罕見(jiàn)的邊界細(xì)胞群體。在樣本1中，研究人員發(fā)現(xiàn)了三陽(yáng)性(ERBB2+/ESR1+/PGR+)DCIS區(qū)域，并識(shí)別了與侵襲性相關(guān)的分子差異。在樣本2中，研究人員識(shí)別了一種罕見(jiàn)的邊界細(xì)胞群體，這些細(xì)胞共表達(dá)腫瘤和肌上皮細(xì)胞標(biāo)記物，可能在DCIS到浸潤(rùn)性癌的過(guò)渡中起關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)展示了多技術(shù)整合在揭示腫瘤異質(zhì)性方面的強(qiáng)大能力，為理解乳腺癌的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，有助于推進(jìn)腫瘤學(xué)研究和診斷治療的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：
Janesick A, Shelansky R, Gottscho AD, et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 2023 Dec 19;14(1):8353. doi: 10.1038/s41467-023-43458-x. PMID: 38114474; PMCID: PMC10730913.