慢病毒轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作、注意事項(xiàng)以及常見問題

一、 慢病毒實(shí)驗(yàn)步驟

慢病毒的實(shí)驗(yàn)流程大致分為：質(zhì)粒構(gòu)建—病毒包裝—病毒收集與濃縮—感染靶細(xì)胞—篩選與驗(yàn)證

1、質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建重組質(zhì)粒，將外源目的基因片段插入質(zhì)粒載體，得到重組質(zhì)粒，在大腸桿菌內(nèi)轉(zhuǎn)化，并抽提得到重組質(zhì)粒DNA。

2、病毒包裝

將重組質(zhì)粒DNA和其他包裝質(zhì)粒按照說明書的一定比例一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)、72小時(shí)分別收獲含病毒的上清。

3、病毒收集濃縮

收集的含病毒上清3000 rpm 離心20min，0.45um濾膜過濾，去除細(xì)胞沉淀。將上清繼續(xù)12000轉(zhuǎn)離心初步濃縮、分裝-80°C貯存。必要時(shí)滴度測定目的基因檢定。超速離心法及PEG沉淀法均可有效濃縮病毒，但前者設(shè)備要求高；后者雖操作簡便，成本低，但效率稍低。

4、慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞

第一天：細(xì)胞接種

以293T細(xì)胞為例，將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞消化收集，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1x10⁵個(gè)/mL，接種到24孔板，每孔加0.5mL，混勻后放37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。由于不同細(xì)胞的生長速度不同，細(xì)胞接種量也會有所不同。一般保證接種的第二天進(jìn)行感染時(shí)細(xì)胞匯合度在30%-50%即可。 

第二天：加病毒轉(zhuǎn)染

觀察293T細(xì)胞生長情況，吸去24孔板內(nèi)細(xì)胞中的舊培養(yǎng)基，加入提前預(yù)熱的新鮮完全培養(yǎng)液，每孔0.25mL，放37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí)。注意動作輕柔，以免吸走細(xì)胞或者將細(xì)胞吹起漂浮。4小時(shí)后每孔補(bǔ)加0.25mL新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。注意：部分孔不加病毒，作為對照組。

第三天：全量換液

轉(zhuǎn)染后第二天，也就是加病毒24小時(shí)，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)是否有異常，并記錄，無異常的情況下吸去24孔板內(nèi)含有病毒的培養(yǎng)液，補(bǔ)加新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

第四-六天：觀察轉(zhuǎn)染效果

若轉(zhuǎn)染了帶熒光基團(tuán)的慢病毒，可以在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)通過倒置熒光顯微鏡檢測其熒光強(qiáng)度從而初步檢測轉(zhuǎn)染效果。也可以在此時(shí)加入適宜濃度的puromycin或其他篩選藥物篩選出成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。注意：對于生長緩慢的細(xì)胞，可以延長觀察時(shí)間至96小時(shí)。

 

二、慢病毒實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

（1）病毒的保存適當(dāng)：病毒短期可存放4℃冰箱保持（不超過一周），長期保存需分裝后-80℃冰箱存放不超過6個(gè)月，使用時(shí)冰上融化，避免反復(fù)凍融而影響病毒活性。超過6個(gè)月，病毒滴度有可能降低。

（2）細(xì)胞狀態(tài)：選擇生長對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞活性好，有利于提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

（3）細(xì)胞接種量：根據(jù)細(xì)胞的增殖速度和接種的培養(yǎng)器皿決定，細(xì)胞接種密度需要適宜，傳代周期在2-3天的，轉(zhuǎn)染前密度在30%-50%。生長緩慢的細(xì)胞系或者原代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前密度約在90%左右。

（4）MOI值：通常MOI值越高，細(xì)胞越難轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞需要計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞接種量。加入病毒的體積(uL)=MOI值X細(xì)胞接種量/病毒滴度（Tu/mL）X1000。

（5）實(shí)驗(yàn)前需要查找文獻(xiàn)資料，需要靶細(xì)胞的培養(yǎng)條件、生長速度、生長形態(tài)、MOI值、宿主細(xì)胞篩選藥物致死濃度等參數(shù)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

（6）細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后，需要觀察細(xì)胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)染后，若細(xì)胞狀態(tài)不佳，可以先不加藥篩選，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，帶狀態(tài)好轉(zhuǎn)后再篩選。若轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，細(xì)胞密度較大，可傳代后待細(xì)胞貼壁或穩(wěn)定后加藥篩選處理。

（7）轉(zhuǎn)染效率的觀察時(shí)間，一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)-72小時(shí)觀察，對于有些增殖緩慢的細(xì)胞，可以延長觀察時(shí)間至96小時(shí)甚至更長。

 

三、實(shí)驗(yàn)常見問題

Q1如何提高慢病毒對細(xì)胞的感染效率?

轉(zhuǎn)染過程中，多種因素會影響慢病毒對細(xì)胞的感染效率，如細(xì)胞自身生長狀態(tài)、細(xì)胞接種數(shù)量、細(xì)胞被慢病毒感染的難易程度(MOI)等，因此保證細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞密度適中感染條件適宜，可以達(dá)到更好的感染效率。對于懸浮細(xì)胞，可采用離心感染的方法，將細(xì)胞吹打吸入離心管中,進(jìn)行低速離心，去掉大部分上清,然后加入適量的病毒液,室溫放置15 min(盡量不要超過30 min),然后將細(xì)胞和病毒液同時(shí)吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染過夜即可。

Q2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡，怎么辦？

轉(zhuǎn)染過程中，多種因素會影響慢病毒對細(xì)胞的感染效率，如細(xì)胞自身生長狀態(tài)、細(xì)胞接種數(shù)量、細(xì)胞被慢病毒感染的難易程度(MOI)等，因此保證細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞密度適中感染條件適宜，可以達(dá)到更好的感染效率。對于懸浮細(xì)胞，可采用離心感染的方法，將細(xì)胞吹打吸入離心管中,進(jìn)行低速離心，去掉大部分上清,然后加入適量的病毒液,室溫放置15 min(盡量不要超過30 min),然后將細(xì)胞和病毒液同時(shí)吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染過夜即可。

Q3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因會整合到染色體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不會嗎？

不論是瞬轉(zhuǎn)還是穩(wěn)轉(zhuǎn)，DNA都會入核并有一定概率隨機(jī)整合到宿主染色體；唯一的區(qū)別在于，穩(wěn)轉(zhuǎn)所用的質(zhì)粒含有抗性基因，后期可以通過藥物篩選，把沒有轉(zhuǎn)進(jìn)目的基因的細(xì)胞殺死，篩選出成功轉(zhuǎn)入目的基因的細(xì)胞，并可以傳代遺傳。而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染由于沒有藥物加壓篩選，加上僅有少量的細(xì)胞中有目的基因整合到染色體，所以傳代后，陽性細(xì)胞會越來越少，導(dǎo)致目的基因表達(dá)量逐漸降低，進(jìn)而不能長期穩(wěn)定表達(dá)。

Q4慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞接種量是多少？

根據(jù)細(xì)胞增殖的速度以及接種培養(yǎng)容器大小來調(diào)整細(xì)胞接種量，以保證在感染后4天左右細(xì)胞剛好快長滿培養(yǎng)皿底部為宜。對大部分細(xì)胞系傳代周期在2~3天，感染前細(xì)胞鋪板的密度保持在20%~30%左右；對于某些原代細(xì)胞，可以在接種時(shí)提高匯合度到50%~60%；對于終末分裂細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞，心肌細(xì)胞等，可以按照90%的匯合度進(jìn)行接種

尚恩生物對常用的細(xì)胞系，原代細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，包括細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）或者紅色熒光蛋白（mCherry、RFP）、細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染化學(xué)發(fā)光LUC、細(xì)胞慢病毒SV40永生化轉(zhuǎn)染，總共近40種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。也可以進(jìn)行指定細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)染。