利用雙因子技術(shù)穩(wěn)定血管再生并改善心梗后心功的研究

文中闡述了采用化學(xué)合成的修飾modified message RNA （modRNA）技術(shù)對(duì)hADSCs進(jìn)行基因修飾，促使其高效表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），這兩種因子在血管生成和抗凋亡中發(fā)揮重要作用。結(jié)果證實(shí)經(jīng)VEGFA和bFGF mRNA增強(qiáng)的hADSCs可促進(jìn)穩(wěn)定血管的再生以及抑制細(xì)胞凋亡，改善心臟傳導(dǎo)紊亂并提高心功能，為心肌梗死的治療提供新的方向。

研究方法：
文中采用電標(biāo)測(cè)系統(tǒng)（Electrical Mapping）檢測(cè)MI后15分鐘和4周的左心室電傳導(dǎo)的變化。分析傳導(dǎo)時(shí)間（CT）、傳導(dǎo)速度（CV）和非均勻性指數(shù)，評(píng)估正常組、心肌梗死手術(shù)組及治療干預(yù)組電整合能力及干預(yù)效果。

研究結(jié)果：
1. 在hADSCs中高效轉(zhuǎn)染modRNA
研究通過GFP報(bào)告基因驗(yàn)證修飾信使RNA（modRNA）在人脂肪來源干細(xì)胞（hADSCs）中的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24小時(shí)后效率達(dá)82.93%，且GFP表達(dá)持續(xù)至少5天，同時(shí)未顯著影響細(xì)胞活力。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染VEGFA和bFGF modRNAs的hADSCs在前2天快速分泌目標(biāo)蛋白，并持續(xù)表達(dá)超過5天，但第7天時(shí)表達(dá)顯著減少。ELISA檢測(cè)證實(shí)，轉(zhuǎn)染組的蛋白分泌水平在所有時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組。結(jié)果表明，modRNA能夠高效轉(zhuǎn)染hADSCs并快速穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)蛋白。
 

圖1. modRNA在hADSCs中的轉(zhuǎn)染效率

2. modRNA修飾的hADSCs分泌蛋白的體外功能
研究評(píng)估VEGFA和bFGF modRNA轉(zhuǎn)染對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）管形成和遷移能力的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGFA或bFGF modRNA的hADSCs顯著促進(jìn)HUVECs管狀結(jié)構(gòu)形成和遷移，且雙基因轉(zhuǎn)染組（hADSCsdual）效果最佳。此外，在缺氧條件下，轉(zhuǎn)染VEGFA或bFGF modRNA顯著抑制H9C2細(xì)胞凋亡，其中bFGF modRNA的抑制作用更強(qiáng)。同時(shí)，轉(zhuǎn)染組條件培養(yǎng)基顯著促進(jìn)平滑肌細(xì)胞（SMCs）增殖，hADSCsdual組效果最為顯著。

圖2. modRNA轉(zhuǎn)染的hADSCs的體外生物學(xué)功能

3. hADSCsdual在體內(nèi)改善MI后的心臟功能
研究評(píng)估m(xù)odRNA轉(zhuǎn)染的hADSCs在MI治療中的潛力。實(shí)驗(yàn)顯示，MI后大鼠心臟功能顯著下降，而hADSCs移植后主要分布于心臟，且未引起明顯病理改變，表明其安全性良好。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hADSCsdual組在移植后72小時(shí)內(nèi)VEGFA和bFGF蛋白表達(dá)顯著高于MI組。超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，MI后2周和4周，hADSCsVEGFA組和hADSCsdual組的心臟功能顯著改善，其中hADSCsdual組效果最佳，LVEF和LVFS顯著提升。研究表明，modRNA修飾的hADSCs，尤其是hADSCsdual，在改善MI后心臟功能障礙方面具有顯著治療潛力。

圖3. hADSCs移植后心臟功能的恢復(fù)

4. hADSCsdual在體內(nèi)促進(jìn)MI后左心室電傳導(dǎo)
研究評(píng)估MI手術(shù)及治療干預(yù)后左心室電傳導(dǎo)的變化。結(jié)果顯示，MI后15分鐘和4周時(shí)，MI組的電傳導(dǎo)紊亂，電活動(dòng)離散度顯著增加。到第四周時(shí)，接受hADSCsVEGFA、hADSCsbFGF或hADSCsdual治療的大鼠電傳導(dǎo)更有序，電活動(dòng)離散度降低。定量分析表明，MI后傳導(dǎo)時(shí)間（CT）延長(zhǎng)，傳導(dǎo)速度（CV）降低，傳導(dǎo)離散度增加；而治療后CT縮短，CV增加，傳導(dǎo)離散度降低。hADSCsdual組的左心室傳導(dǎo)參數(shù)改善最顯著，表明其作為一種新治療方法在改善左心室電傳導(dǎo)方面具有治療潛力。

圖4. hADSCs移植后左心室電傳導(dǎo)功能的恢復(fù)

5. hADSCs^dual減少心臟纖維化并保留心室壁厚度建模4周后，HE和Masson染色顯示，hADSCs^dual組大鼠心臟再生組織比例增加，左心室瘢痕面積顯著減小，心室壁厚度保持良好。Vimentin染色表明，hADSCs^dual組梗死區(qū)浸潤(rùn)性成纖維細(xì)胞數(shù)量較少。結(jié)果表明，hADSCs^dual減少心臟纖維化，緩解心室重構(gòu)，并抑制MI引起的心肌損傷進(jìn)展。

圖5. MI及治療后大鼠心室形態(tài)學(xué)分析

6. hADSCs^dual減少梗死區(qū)細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖
研究hADSCs 體內(nèi)植入效果，發(fā)現(xiàn)多數(shù)聚集在梗死區(qū)及邊緣區(qū)，預(yù)處理VEGFA和/或bFGF modRNA的hADSCs在梗死區(qū)的存活率顯著更高。TUNEL染色顯示，hADSCs^dual組凋亡細(xì)胞比例顯著低于hADSCs^Luc組。Ki-67染色證實(shí)，hADSCs^dual顯著促進(jìn)梗死區(qū)細(xì)胞增殖。免疫染色發(fā)現(xiàn)，少量細(xì)胞共表達(dá)cTnT和Ki-67，但具體細(xì)胞類型難以確定。

圖6. MI及hADSCs移植后梗死區(qū)的細(xì)胞凋亡與增殖