小分子不同靶點(diǎn)篩選方案的技術(shù)路線、優(yōu)勢(shì)及經(jīng)典案例分享

丨  GPCR膜蛋白芯片優(yōu)勢(shì)
1. 篩選直接結(jié)合的膜蛋白靶點(diǎn)，假陽性率較低
2. 采用病毒表達(dá)膜蛋白，避免了細(xì)胞系表達(dá)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)干擾，保留了GPCR膜蛋白的天然構(gòu)象與生物學(xué)活性
3. 芯片覆蓋多種GPCR蛋白和RTK激酶，結(jié)合蛋白范圍更廣，性價(jià)比高
4. 熒光檢測(cè)結(jié)合反應(yīng)，高靈敏度檢測(cè)

經(jīng)典案例：強(qiáng)啡肽結(jié)合膜蛋白篩選
強(qiáng)啡肽（ Dynorphin A ）是一種抑制性神經(jīng)肽，在鎮(zhèn)痛等研究中常用，但直接靶點(diǎn)仍不清楚。本研究利用GPCR膜蛋白芯片篩選，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)啡肽可以與3種膜蛋白結(jié)合，其中結(jié)合強(qiáng)度最強(qiáng)的是一種叫作OPRD1的阿片受體A類GPCR蛋白，非常符合研究預(yù)期。

No.3  ABPP基于炔基標(biāo)記的點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)
ABPP（Activity-Based Protein Profiling）是在點(diǎn)擊化學(xué)和LC-MS質(zhì)譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的小分子化合物靶點(diǎn)蛋白的篩選技術(shù)。將小分子進(jìn)行炔基標(biāo)記后處理細(xì)胞，通過簡(jiǎn)便高效的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將結(jié)合上靶點(diǎn)蛋白的炔基小分子連接到帶有疊氮的磁珠上，通過磁珠離心獲取小分子靶向結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白。進(jìn)一步，通過LC-MS分析出小分子的潛在靶點(diǎn)蛋白。

丨 技術(shù)路線
Step1：小分子進(jìn)行炔基標(biāo)記 
Step2：標(biāo)記了炔基的小分子與細(xì)胞共孵育
Step3：預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用熒光標(biāo)記的疊氮與細(xì)胞裂解液共同孵育，通過熒光凝膠以及熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)反應(yīng)條帶
Step4：正式實(shí)驗(yàn)，使用生物素標(biāo)記的疊氮與細(xì)胞裂解液共同孵育
Step5：利用鏈霉親和素磁珠釣出靶蛋白

Step6：質(zhì)譜分析，鑒定靶蛋白 

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)
1.  炔基修飾對(duì)小分子的活性和結(jié)構(gòu)影響小，幾乎不干擾小分子原本的生物活性
2.  炔基標(biāo)記的小分子可在活細(xì)胞水平上進(jìn)行靶點(diǎn)篩選
3.  研究方向明確，篩選到的是與研究方向相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白
4.  擁有完整的小分子炔基標(biāo)記體系

經(jīng)典案例：ABPP篩選天然產(chǎn)物野馬追內(nèi)酯B抗癌靶點(diǎn)
南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院聯(lián)合中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)利用炔基標(biāo)記天然產(chǎn)物野馬追內(nèi)酯B（EB），合成了保留原有抗三陰乳腺癌活性的小分子探針，并利用ABPP技術(shù)篩選EB的靶點(diǎn)蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EB通過靶向BCAT1介導(dǎo)的BCAA代謝抑制SHOC2/RAS/ERK激活，最終抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)了三陰乳腺癌的治療新靶標(biāo)，為其臨床新藥開發(fā)提供了新的思路。

No.4  Pull down+MS技術(shù)
小分子藥靶篩選的Pull down實(shí)驗(yàn)是一種有效的篩選藥物與潛在靶蛋白之間相互作用的體外技術(shù)。利用生物分子之間的親和力原理，將生物素標(biāo)記的小分子化合物固定在鏈霉親和素的磁珠上，與蛋白裂解液進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束后與小分子結(jié)合的蛋白可以通過質(zhì)譜檢測(cè)，將下游的靶點(diǎn)蛋白鑒定出來。該方法簡(jiǎn)單易行，操作方便，在藥靶篩選方面已得到廣泛的應(yīng)用。

丨 技術(shù)路線
Step1：小分子進(jìn)行生物素標(biāo)記 
Step2：標(biāo)記了生物素的小分子與鏈霉親和素磁珠共同孵育，將小分子固定到磁珠上，形成小分子探針
Step3：將小分子探針與細(xì)胞裂解液共同孵育
Step3：離心、洗脫，獲取靶蛋白
Step4：質(zhì)譜分析，對(duì)靶蛋白進(jìn)行鑒定

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)
1.  不受結(jié)合原理限制，適用范圍廣
2.  研究方向明確，篩選到的是與研究方向相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白
3.  鑒定到的靶點(diǎn)蛋白數(shù)量較多 
4.  可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)與小分子結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白及其互作網(wǎng)絡(luò)譜

經(jīng)典案例：Pull down +MS篩選蘇木酮A的抗炎靶點(diǎn)
2017年7月北京大學(xué)屠鵬飛教授團(tuán)隊(duì)利用Biotin-SA探針進(jìn)行Pull down+MS實(shí)驗(yàn)“垂釣”蘇木酮（SA）的潛在靶點(diǎn)蛋白，發(fā)現(xiàn)肌苷單磷酸脫氫酶2（IMPDH2）是SA的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，通過SPR和CETSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了SA與IMPDH2的直接作用關(guān)系，后續(xù)通過功能性實(shí)驗(yàn)證明了蘇木酮A在抗神經(jīng)炎癥方面的作用功效。

No.5  SPIDER基于鄰近標(biāo)記技術(shù)的膜蛋白靶點(diǎn)篩選技術(shù)
SPIDER技術(shù)的原理基于結(jié)核分枝桿菌類泛素蛋白酶體系統(tǒng)中底物Pup分子在體外能夠招募PafA連接酶發(fā)揮鄰近標(biāo)記作用。將小分子進(jìn)行生物素標(biāo)記后處理活細(xì)胞，當(dāng)小分子與靶蛋白（Target）發(fā)生相互作用時(shí)，會(huì)同時(shí)與偶聯(lián)了生物素的SA_m-Pup^E靠近。在PafA酶的催化作用下，Pup^E的C末端會(huì)與Target蛋白表面的賴氨酸殘基共價(jià)相連，形成類泛素連接反應(yīng)，進(jìn)一步，通過LC-MS分析出小分子的潛在靶點(diǎn)蛋白。該過程將小分子與蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)結(jié)合相互作用轉(zhuǎn)換為SA_m-Pup^E與靶蛋白的共價(jià)連接，從而能夠穩(wěn)定地用于后續(xù)靶蛋白的富集、鑒定和分析。

丨 技術(shù)路線
Step1：小分子進(jìn)行生物素標(biāo)記 
Step2：標(biāo)記了生物素的小分子與活細(xì)胞共同反應(yīng)
Step3：引入帶有Pup^E的鏈酶親和素和PafA酶 
Step3：利用生物素磁珠釣取靶蛋白
Step4：質(zhì)譜分析，對(duì)靶蛋白進(jìn)行鑒定

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)
1. 在活細(xì)胞水平上進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，能夠保證膜蛋白的活性；
2. 將小分子與互作蛋白轉(zhuǎn)為共價(jià)結(jié)合，形成類泛素化連接反應(yīng)；
3. 嚴(yán)苛洗脫條件降低非特異性干擾。

經(jīng)典案例：SPIDER篩選SARS-CoV-2S1蛋⽩受體結(jié)合區(qū)RBD的靶點(diǎn)蛋白
上海交通大學(xué)首次利用SPIDER技術(shù)檢測(cè)了SARS-CoV-2S1蛋⽩受體結(jié)合區(qū)RBD的靶蛋白，同時(shí)進(jìn)行了毒性測(cè)試，證明了整個(gè)類泛素反應(yīng)的無毒害性。將SPIDER實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果與BioGRID數(shù)據(jù)庫(kù)相比較取交集，篩選到SARS-CoV-2S1蛋⽩的膜上受體蛋白ACE2，后續(xù)通過體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)證明了二者之間的直接作用關(guān)系。

丨 方案二：非修飾的策略
No1. DARTS藥物親和反應(yīng)靶向穩(wěn)定性技術(shù)
藥物親和反應(yīng)靶向穩(wěn)定性技術(shù)（Drug Affinity Responsive Target Stability，DARTS）是由美國(guó)University of California科研團(tuán)隊(duì)于2009年提出的。該方法操作簡(jiǎn)便，可適用于大多數(shù)小分子化合物。DARTS技術(shù)是基于蛋白的酶解穩(wěn)定原理，即小分子與蛋白結(jié)合后，可能使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋或聚集，從而使蛋白對(duì)廣譜的蛋白酶變得更加耐受或敏感。通過SDS-PAGE分離，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的條帶比較，最后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，即可得到小分子的潛在靶點(diǎn)蛋白。

丨 技術(shù)路線
Step1：預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索最適酶濃度
Step2：正式實(shí)驗(yàn)，小分子與靶細(xì)胞裂解液共孵育，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取最適酶濃度處理，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳
Step3：利用質(zhì)譜鑒定靶點(diǎn)蛋白

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)
1. 小分子無需修飾，其構(gòu)象與活性不產(chǎn)生影響
2. 實(shí)驗(yàn)原理簡(jiǎn)單，服務(wù)周期短
3. 每組3重復(fù)，排除個(gè)體差異
4. 不適于在自然條件下抵抗蛋白質(zhì)水解的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域

經(jīng)典案例：外泌體+DARTS發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1對(duì)結(jié)直腸癌的治療作用
上海中醫(yī)藥大學(xué)曙光醫(yī)院聯(lián)合了藥物靶點(diǎn)和外泌體機(jī)制兩大研究熱點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)攜帶circ-0034880的外泌體可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移，隨后篩選到了能夠顯著抑制該環(huán)狀RNA表達(dá)的中藥活性成分人參皂苷Rb1。進(jìn)一步采用DARTS技術(shù)鑒定到了人參皂苷Rb1的作用靶點(diǎn)是與環(huán)狀RNA生物發(fā)生相關(guān)的蛋白QKI。通過CETSA和SPR方法驗(yàn)證了二者間的相互作用。最后體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)證明了Rb1預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞來源的外泌體失去了促進(jìn)癌癥肝轉(zhuǎn)移的作用。

No2. LiP-MS限制性酶解-質(zhì)譜分析技術(shù)
限制性酶解-質(zhì)譜分析技術(shù)LiP-MS（Limited proteolysis-coupled mass spectrometry）是一種基于有限蛋白酶切的化合物靶點(diǎn)篩選技術(shù)，其獨(dú)特之處在于無需對(duì)化合物進(jìn)行修飾即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定化合物結(jié)合肽段進(jìn)行篩選。小分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合后，會(huì)形成空間位阻，防止蛋白酶K等廣譜蛋白酶對(duì)靶點(diǎn)蛋白特定多肽位點(diǎn)的水解。進(jìn)一步利用胰酶在精氨酸和賴氨酸特定位點(diǎn)消化所有蛋白質(zhì)后再進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。通過對(duì)蛋白酶K和胰酶切割差異化位點(diǎn)的分析，可以找到小分子作用的多肽位點(diǎn)以及靶點(diǎn)蛋白。

丨 技術(shù)路線
Step1：小分子與靶細(xì)胞裂解液共孵育
Step2：PK酶處理后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳
Step3：酶解樣品，利用質(zhì)譜鑒定靶點(diǎn)蛋白

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)
1. 無需對(duì)小分子進(jìn)行修飾，避免了因修飾可能導(dǎo)致的小分子活性改變，服務(wù)周期短
2. 能夠篩選到小分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合的肽段，可進(jìn)行個(gè)性化數(shù)據(jù)分析
3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)置每組3重復(fù)，排除個(gè)體差異
4. 更適用于代謝產(chǎn)物及小分子量化合物的靶點(diǎn)篩選研究

經(jīng)典案例：LiP-MS技術(shù)繪制代謝物-蛋白相互作用圖譜
蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院2018年發(fā)表在Cell上的文章首次利用LiP-MS技術(shù)系地繪制了代謝物的蛋白結(jié)合譜，鑒定出三羧酸循環(huán)中大多數(shù)代謝物的靶點(diǎn)蛋白。在天然細(xì)胞基質(zhì)中直接進(jìn)行的代謝物-蛋白質(zhì)相互作用和結(jié)合位點(diǎn)的系統(tǒng)分析，并確定了二者結(jié)合后靶點(diǎn)蛋白整體構(gòu)象發(fā)生變化的原因。

No.3 CETSA細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)
細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是2013年由瑞典Karolinska研究所團(tuán)隊(duì)研發(fā)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)基于蛋白的熱穩(wěn)定性原理，即小分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合后會(huì)增強(qiáng)靶點(diǎn)蛋白的熱穩(wěn)定性。隨著溫度的升高，部分蛋白會(huì)逐漸降解。相同溫度下，結(jié)合了藥物的蛋白質(zhì)具有更高的熱穩(wěn)定性，相比未結(jié)合藥物的蛋白質(zhì)，未降解蛋白的量會(huì)提高，同時(shí)該復(fù)合蛋白的熱熔曲線發(fā)生改變，進(jìn)一步通過質(zhì)譜鑒定到小分子的潛在靶點(diǎn)蛋白。

丨 技術(shù)路線
Step1：小分子與靶細(xì)胞共孵育
Step2：進(jìn)行梯度升溫處理后離心，從沉淀蛋白中分離出可溶性蛋白
Step3：收集上清液，利用質(zhì)譜鑒定靶點(diǎn)蛋白

丨 特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)
1.  小分子無需修飾，其構(gòu)象與活性不產(chǎn)生影響
2.  實(shí)驗(yàn)原理簡(jiǎn)單，服務(wù)周期短
3.  需要提供靶細(xì)胞，研究方向明確
4.  不適用于在自然條件下耐溫的蛋白質(zhì)

經(jīng)典案例：CETSA+MS助力揭示天然產(chǎn)物緩解神經(jīng)性疼痛的新機(jī)制
2023年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所庾石山團(tuán)隊(duì)利用CETSA+MS（TPP）技術(shù)，鑒定到木藜蘆烷毒素Rho的主要靶點(diǎn)蛋白N-乙基馬來酰亞胺敏感融合蛋白 （NSF），通過ITC與分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了二者的的直接作用關(guān)系。結(jié)果表明Rho通過抑制NSF介導(dǎo)的Cav2.2鈣通道跨膜運(yùn)輸緩解神經(jīng)性疼痛。