體外ADME研究——藥物Ⅱ相代謝穩(wěn)定性試驗研究的常用體外模型工具

Keywords：Microsomes, Phase Ⅱ Metabolism; Hepatocytes; UDPGA; UGT; Drug Metabolism; Phase Ⅰ Metabolism

藥物代謝（Drug Metabolism）研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關(guān)系。由于肝臟是藥物代謝的主要場所，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ)。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體（Liver Microsomes）體外溫孵法、重組P450酶（Recombinant P450 Enzyme）體外溫孵法、肝細胞（Hepatocytes）體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體與肝細胞體外溫孵法較其它方法而言，制備簡單，代謝過程快，重現(xiàn)性好，易大量操作，可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實際工作中應(yīng)用較為普遍。

一、藥物的Ⅱ相代謝反應(yīng)
藥物代謝是指藥物在體內(nèi)發(fā)生的化學(xué)變化，導(dǎo)致藥物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，也被稱為藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化。肝臟是藥物代謝的主要器官，藥物在肝內(nèi)藥物代謝酶的作用下經(jīng)過不同程度的結(jié)構(gòu)變化，即I相代謝反應(yīng)（Phase I Metabolism）和II相代謝反應(yīng)（Phase II Metabolism）。其中，Ⅱ相代謝（Phase Ⅱ Metabolism），又稱結(jié)合反應(yīng)，指Ⅰ相代謝產(chǎn)物或原型藥物在酶的影響下與內(nèi)源性小分子（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）結(jié)合或經(jīng)甲基化、乙�；�排出體外。藥物的結(jié)合反應(yīng)，常常使其轉(zhuǎn)化為無活性的代謝物，且極性增加，以便藥物排出體外。

在藥物的Ⅱ相代謝中，葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要、最普遍的結(jié)合反應(yīng)，而該類型的發(fā)生通常需UGT來介導(dǎo)。UGT家族是人體內(nèi)僅次于CYP450家族的第2大藥物代謝酶。UGT催化的葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）為葡萄糖醛酸的供體將一分子的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移到含有羥基、羧基、氨基、巰基以及酸性碳原子等基團的脂溶性小分子底物上。葡萄糖醛酸和小分子底物的結(jié)合使這些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，進而更容易被排出體外。
UGT介導(dǎo)的葡萄糖醛酸結(jié)合代謝不僅會顯著影響藥物的口服生物利用度和藥物的體內(nèi)藥動學(xué)過程，同時還與一些臨床藥物-藥物相互作用、藥物-草藥相互作用、藥物-食物相互作用，以及高膽紅素血癥、癌癥、自身免疫性肝炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，合理的體外代謝模型于研究藥物的二相代謝反應(yīng)具有重要意義。目前，常使用的體外代謝模型有肝微粒體（Liver Microsomes）和肝細胞（Hepatocytes）兩種。

二、肝微粒體體外溫孵法
微粒體（Microsomes）是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，是異質(zhì)性的集合體。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分，在體外實驗中具有蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)糖基化和脂類合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能，廣泛存在于肝臟等多個器官中，主要為I相細胞色素CYP450酶（Cytochrome P450）和II相酶系UGT等，囊括了多種類型藥物的不同代謝途徑。

2.1肝微粒體體外孵育體系的建立
Ⅱ相代謝穩(wěn)定性（Phase II Metabolic Stability）研究的肝微粒體體外孵育體系，是由肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，由微粒體中的糖醛酸轉(zhuǎn)移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進行生化反應(yīng)的體系。

推薦的孵育體系為：每個孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液（0.1M PBS），NADPH再生系統(tǒng)（1.3mM NADP，3.3mM的6-磷酸葡萄糖，0.4U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂，0.05mM 檸檬酸鈉），UGT孵育系統(tǒng)（5mM UDPGA，5mM D-葡萄糖二酸-1.4-內(nèi)酯，50μg/mg蛋白的丙甲菌素），0.1 mg/mL~1 mg/mL肝微粒體蛋白，合適濃度的待測物，于37°C水浴孵育。每個樣品平行3次，將待測物換為7-羥基香豆素，作為陽性對照；陰性對照組分三組：a.只加UDPGA；b.不加UDPGA，用0.1M PBS緩沖液替代，理論上不代謝；c. 只包含受試物和0.1M PBS緩沖液。于預(yù)設(shè)的反應(yīng)時間點，如0,2,5,10,15,30,60 min后加入等體積預(yù)冷的乙腈終止反應(yīng)。

2.2 IPHASE肝微粒體II相代謝穩(wěn)定性研究
為驗證孵育體系的適用性，IPHASE以蛋白濃度為0.5mg/ml 的lot number 為23H018猴肝微粒體為體外孵育模型，驗證終濃度為100μM的陽性藥物7-羥基香豆素在體外的穩(wěn)定性，并利用色譜峰面積作為計算數(shù)據(jù)。即通過時間點占初始點百分比的回歸曲線計算確定化合物體外的半衰期。將受試物的零時濃度作為100%，2,5,10和30min各時間點濃度與零時濃度相比得剩余百分數(shù)，各時間點的底物剩余百分數(shù)的自然對數(shù)與孵育時間經(jīng)線性回歸，最終求得斜率k。最終再由計算公式可進一步得到半衰期和清除率結(jié)果。 整個孵育體系如下：

組分	體積/體系
0.1M PBS緩沖液	122μL或142μL
NADPH再生系統(tǒng)	12μL
UGT孵育系統(tǒng)	60μL或40μL
7-羥基香豆素	1μL
肝微粒體	5μL
Total	200μL

結(jié)果如下： 半衰期=5.49 min，清除率=1263 uL/mg/min
除微粒體外，亞細胞結(jié)構(gòu)S9和胞質(zhì)液也常用于藥物的代謝輪廓研究。前者包含了完整的I相和Ⅱ相代謝酶的活性其孵育體系類似于微粒體，但其CYP450酶和UGT酶的純度較微粒體而言略低，因此S9可用于非主要酶系代謝的體外研究模型之一；后者包含了可溶性的Ⅱ相代謝酶，如NAT、GST、ST、TPMT等，在很多化療藥物的激活與解毒過程中發(fā)揮重要作用，由于該體系中只有Ⅱ相代謝酶存在，且相對于肝S9來講酶活還很高，因此可通過加入不同的輔酶來單獨研究某個亞型酶的代謝。

三、肝細胞體外溫孵法
除了肝微粒體，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）也是II相代謝穩(wěn)定性試驗研究的常用體外模型工具之一。相較于肝微粒體這類亞細胞結(jié)果，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結(jié)合酶【如細胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶，為滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的還原酶】，也包括胞質(zhì)酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。

鑒于此，IPHASE用Lot number為K0125A051的小鼠原代肝細胞進行體外肝細胞孵育體系的驗證。IPHASE技術(shù)人員將細胞密度為0.5 million cells/mL的肝細胞同終濃度為1uM的陽性藥物米達唑侖共同孵育，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培育0、5、30min下藥物的剩余量，由此得出藥物的半衰期及清除率，符合IPHASE長久以來積累的歷史數(shù)據(jù)范圍值。因此，IPHASE原代肝細胞具有活性高、批次間穩(wěn)定性差異小及純度高等優(yōu)勢！ 結(jié)果為：半衰期=5.11 min，清除率=271 uL/mg/min
綜上所述，II相代謝穩(wěn)定性試驗研究在藥物研發(fā)中至關(guān)重要，可幫助評估代謝途徑、預(yù)測清除率、優(yōu)化藥物設(shè)計、評估相互作用、支持臨床試驗、確保安全性，并滿足法規(guī)要求，因此，選擇合適的產(chǎn)品及體外孵育系統(tǒng)對該試驗研究至關(guān)重要！

四、IPHASE產(chǎn)品
因此，IPHASE作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者，為滿足不同客戶的需求，深耕細作，研發(fā)生產(chǎn)出多種屬、多品系的肝微粒體和肝S9，并提供相應(yīng)II相代謝穩(wěn)定性研究的配套試劑，并嚴格質(zhì)控，致力于為客戶提供最優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。

名稱	規(guī)格
人/猴/犬/大鼠/小鼠/雞/羊/豬/魚/貓肝微粒體	0.5mL,20mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠/豬腸微粒體	0.15mL,10mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠/豬腎微粒體	0.5mL,10mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠/豬肺微粒體	0.5mL,10mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠/豬/兔肝S9	0.5mL,20mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠/豬腸S9	1mL,4mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠/豬腎S9	1mL,5mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠/兔肺S9	1mL,5mg/mL
犬/大鼠/豬 皮膚S9	0.5mL,4mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠/豬/兔肝胞質(zhì)液	1mL,10mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠腸胞質(zhì)液	1mL,4mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠腎胞質(zhì)液	1mL,5mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠肺胞質(zhì)液	1mL,5mg/mL
人/猴/犬/大鼠/小鼠/雞/豬/貓懸浮肝細胞	2/5million
人/猴/犬/大鼠/小鼠/雞/豬/貓貼壁肝細胞	2/5million
人/動物肝細胞復(fù)蘇培養(yǎng)基	10/50mL
鋪板培養(yǎng)基	20mL
維持培養(yǎng)基	50mL
代謝培養(yǎng)基	10mL
6孔/12孔/24孔/48孔/96孔膠原包被板	1/5塊
Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試劑盒	0.2mL*100 test
Ⅱ相代謝穩(wěn)定性試劑盒(UGTs)	0.2mL*50 test
NADPH再生系統(tǒng)	A液5mL,B液1mL
UGT孵育系統(tǒng)	3mL
0.1M PBS緩沖液(pH7.4)	100mL
50mM Tris-HCL緩沖液(pH7.5)	100mL
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原型)NADPH	100mg

產(chǎn)品特點：
合規(guī)性 生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得，來源清晰。 
安全性 生產(chǎn)組織均經(jīng)過病原檢測，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。
高質(zhì)量 生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過嚴格的內(nèi)部質(zhì)控，且同批次數(shù)量多，批次間差異性小。
可定制 可根據(jù)客戶特殊需求，提供特殊種屬、特殊組織產(chǎn)品的定制服務(wù)。
高服務(wù) 高質(zhì)量的售后服務(wù)，為試驗順利保駕護航。
IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗，推出了多領(lǐng)域、多種類的高端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學(xué)品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品，望廣大科研工作者來電咨詢，咨詢熱線400-127-6686。
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