高分辨化學(xué)成像顯微鏡助力組織內(nèi)微塑料與植物化學(xué)成像研究

導(dǎo)讀

近年來，熒光顯微鏡技術(shù)的迅猛發(fā)展極大地改變了生命科學(xué)的研究方式，已經(jīng)成為研究者對細胞、組織進行成像的重要方法。傳統(tǒng)熒光顯微鏡雖能快速實現(xiàn)目標(biāo)定位，但存在諸多局限性。在組織內(nèi)微塑料成像方面，其依賴的熒光標(biāo)記易脫落、熒光強度會衰減，特異性檢測難以實現(xiàn)，且易受組織內(nèi)其他熒光物質(zhì)的干擾，空間分辨率也無法清晰呈現(xiàn)微塑料的分布和形態(tài)。在植物化學(xué)成像中，熒光標(biāo)記存在標(biāo)記困難、特異性差以及可能干擾細胞生理過程等問題，同時，傳統(tǒng)熒光顯微鏡在空間分辨率和化學(xué)信息獲取上能力有限，難以在亞微米尺度上對植物細胞內(nèi)的復(fù)雜化學(xué)成分進行精確成像和分析。這些問題嚴(yán)重限制了微塑料在組織內(nèi)行為和植物細胞內(nèi)化學(xué)成分的深入研究。

新一代化學(xué)成像顯微鏡

美國PSC公司研發(fā)的新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage，為上述問題提供了創(chuàng)新性解決方案。mIRage除了兼具傳統(tǒng)熒光顯微鏡的熒光成像功能之外，還采用新型光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)，實現(xiàn)了對物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進行化學(xué)成像，突破了傳統(tǒng)化學(xué)成像在空間分辨率上的瓶頸，其化學(xué)成像分辨高達500 nm，可在亞微米尺度上表征細胞組織內(nèi)的非標(biāo)記目的蛋白或分子。這種直接對分子結(jié)構(gòu)進行無標(biāo)記化學(xué)成像的能力，有效解決了熒光顯微鏡在化學(xué)成分分析上的不足。在微塑料研究中，即使是粒徑僅為2 μm的微塑料顆粒，mIRage也能對其進行高分辨率的化學(xué)成分分析，獲得清晰的紅外光譜圖，解決了傳統(tǒng)方法無法分析微小顆粒成分的難題。在植物研究中，mIRage能夠?qū)χ参锛毎�壁中的纖維素、木質(zhì)素等成分進行無標(biāo)記的化學(xué)成像，清晰呈現(xiàn)其分布情況，為植物代謝組學(xué)研究提供了有力支撐。

高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage

mIRage的特有優(yōu)勢：
• 亞微米空間分辨的紅外光譜和拉曼成像（~500 nm）；
• 與透射模式相媲美的反射模式下的圖譜效果；
• 非接觸測量模式—使用簡單快捷，無交叉污染風(fēng)險；
• 很少或無需樣品制備過程(無需薄片), 可測試厚樣品；
• 可透射模式下觀察溶液中的樣品；
• 實現(xiàn)同時同地相同分辨率的IR和Raman測試；
• 熒光顯微成像實現(xiàn)熒光標(biāo)記樣品快速定位。

作為美國PSC公司在中國的獨家代理，Quantum Design中國于2020年將高分辨化學(xué)成像顯微鏡—mIRage系統(tǒng)引入國內(nèi)，助力科研工作者在多個研究方向取了眾多突破性成果，以下將針對組織內(nèi)微塑料等領(lǐng)域的成果，展示mIRage的超卓性能和先進技術(shù)。

一、助力組織內(nèi)微塑料的成像與分析

中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心的科研團隊利用光學(xué)光熱紅外技術(shù)（O-PTIR），以聚乙烯納米塑料（PE-NPs）為研究對象，深入剖析了小鼠模型中PE-NPs的分布和影響。該研究聚焦于父代暴露于PE-NPs對自身及其后代生殖健康的潛在影響，以及腸道微生物群和微RNA（miRNA）在這一過程中的作用機制。研究成果以“MicroRNA and Gut Microbiota Alter Intergenerational Effects of Paternal Exposure to Polyethylene Nanoplastics”為題發(fā)表于《ACS Nano》（影響因子15.8）上。

科研人員利用光學(xué)光熱紅外技術(shù)（O-PTIR），成功檢測了聚乙烯納米塑料（PE-NPs）在小鼠血清和睪丸組織中的分布情況。該技術(shù)通過檢測樣品因紅外吸收產(chǎn)生的光熱效應(yīng)，實現(xiàn)了亞微米級別的高分辨率成像，能夠精確定位PE-NPs的存在。其非接觸式的檢測方式，避免了對生物組織的損傷，尤其適用于復(fù)雜生物樣品的分析。

如上圖所示，研究人員借助O-PTIR技術(shù)對檢測到的聚乙烯特定振動頻率（2917.33, 2848.55, 1462.04, 和 1118.71 cm⁻¹）的成像，揭示了PE-NPs在F1代雄性小鼠睪丸組織中的分布特征，為深入理解PE-NPs對生殖健康的潛在影響提供了重要證據(jù)，證實了父代暴露于PE-NPs不僅影響自身健康，還可能通過跨代效應(yīng)影響后代的生殖健康。

二、助力植物的化學(xué)成像

法國國家農(nóng)業(yè)食品與環(huán)境研究院（INRAE）的Nicolas Reynoud研究團隊利用高分辨化學(xué)成像顯微鏡mIRage，結(jié)合原子力顯微鏡（AFM）和拉曼光譜技術(shù)，對番茄果實表皮的角質(zhì)層在果實發(fā)育過程中的微觀結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)進行了多模態(tài)成像研究。研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)層的力學(xué)性質(zhì)在果實發(fā)育過程中表現(xiàn)出顯著的空間和時間異質(zhì)性，包括深度方向的力學(xué)梯度和“柔軟”的中央凹槽。這些力學(xué)性質(zhì)的變化與角質(zhì)層的化學(xué)和結(jié)構(gòu)異質(zhì)性密切相關(guān)。該成果以“Cuticle architecture and mechanical properties: a functional relationship delineated through correlated multimodal imaging”為題發(fā)表于《New Phytologist》（影響因子10.3）上。

如下圖所示，通過O-PTIR技術(shù)，研究者觀察到角質(zhì)層中脂質(zhì)、多糖和酚類化合物的空間異質(zhì)性。在角質(zhì)層深度方向，從表皮細胞表面到角質(zhì)層表面，cutin/多糖比例呈現(xiàn)梯度變化，cutin含量逐漸增加。在果實發(fā)育的后期（40天后），角質(zhì)層中酚類化合物（如p-香豆酸和黃酮類）積累增多，且主要分布于角質(zhì)層的特定區(qū)域。通過將O-PTIR成像數(shù)據(jù)與AFM測得的彈性模量進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)晶纖維素和果膠的拉曼強度與彈性模量呈正相關(guān)，而脂質(zhì)和p-香豆酸的拉曼強度與彈性模量呈負相關(guān)。在角質(zhì)層中央凹槽區(qū)域，O-PTIR成像顯示其化學(xué)成分與周圍區(qū)域存在差異，這可能與該區(qū)域較低的彈性模量有關(guān)。

通過使用mIRage顯微鏡進行的O-PTIR技術(shù)，研究者揭示了番茄果實角質(zhì)層在果實發(fā)育過程中化學(xué)成分的深度分布和變化，明確了這些化學(xué)異質(zhì)性與角質(zhì)層的納米力學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)，為理解植物角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系提供了新的視角，也為仿生材料的設(shè)計奠定了理論基礎(chǔ)。

三、助力藥學(xué)研究:開發(fā)新型納米無定形載藥顆粒

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所團隊開發(fā)了基于益生元的阿托伐他�。ˋT）納米無定形載藥顆粒（PANA）。該團隊借助mIRage成功實現(xiàn)對該載藥顆粒的原位成分分析。該結(jié)果以"Prebiotic-Based Nanoamorphous Atorvastatin Attenuates Nonalcoholic Fatty Liver Disease by Retrieving Gut and Liver Health"為名發(fā)表于Small Structures（影響因子13.9）上。

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 的發(fā)病機制復(fù)雜，脂質(zhì)代謝紊亂引起的脂毒性是主要危險因素之一。阿托伐他汀 (AT) 雖為廣泛使用的降脂藥物，但存在腸道吸收率低、破壞腸道菌群等問題。研究者構(gòu)建的PANA載藥顆粒在肝臟組織中藥物積累效果更佳，且能有效恢復(fù)腸道健康，重建腸道菌群，改善腸道免疫力、屏障完整性并減輕炎癥。

如上圖所示，該研究團隊使用mIRage對PANA的化學(xué)成分與空間分布進行了鑒定。通過分析菊粉（益生元主要成分）、AT、PANA的紅外光譜，發(fā)現(xiàn)AT 和菊粉在顆粒中均勻混合。PANA中隨機選擇的樣品的紅外拉曼光譜如圖C（左）所示。AT中1,523 cm^-1處的羰基吸收在菊粉樣品中沒有信號為AT的特征峰（菊粉無此吸收峰）。按照 1,523 cm^-1（綠色）和 1,036 cm^-1（紅色）的映射，活性 AT 和益生元基質(zhì)的圖像在掃描區(qū)域（黃色）顯示出相同的分布。此外，在 PANA 顆粒中可以觀察到 AT 在 1,580 cm^-1的苯吸收、1,457 cm^-1的強 C-C 吸收和菊粉在 1,164 cm^-1 的 C-O 拉伸。以上數(shù)據(jù)清楚地證實了活性藥物在益生元基質(zhì)中的封裝和相對均勻的分布。

這項研究使用mIRage對載藥顆粒進行了化學(xué)顯微成像，準(zhǔn)確表明不同化學(xué)成像在藥物顆粒內(nèi)的空間分布，為制藥工程探索藥物成分的空間分布提供了化學(xué)顯微成像利器。

除了上述應(yīng)用外，mIRage這一熒光、紅外、拉曼三合一的化學(xué)成像顯微還在多個科研領(lǐng)域有所應(yīng)用：

1.  環(huán)境微塑料

微塑料顆粒（~600 nm）的O-PTIR光譜及成像分析
(引自Microscopy Today, 2022, 17, 3, 76-85)

2. 高分子材料

1210 cm^-1處采集的PP/PTFE的O-PTIR光譜和顯微圖像
(引自Materials & Design, 211 (2021), 17, 110157)

3. 半導(dǎo)體

薄膜晶體管顯示器中污染物的O-PTIR分析

器件表面缺陷的紅外和拉曼光譜同步（同時間、同位置）分析
(引自Microscopy Today, 2020, 28, 3, 26-36)

4. 生命科學(xué)

腦組織的明場顯微圖像、O-PTIR光譜及成像分析

5. 文物鑒定

柯羅19世紀(jì)繪畫作品中鋅皂異質(zhì)性的O-PTIR顯微光譜及成像分析
(引自Anal. Chem. 2022, 94, 7, 3103–3110)

mIRage國內(nèi)部分發(fā)表文章一覽

☛ 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)借助mIRage成功實現(xiàn)對玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征。該工作發(fā)表在Science of the Total Environment上。

☛ 中科院過程工程研究所使用mIRage對利拉魯肽微球的藥物與載藥顆粒的化學(xué)成分與空間分布進行了鑒定，該成果發(fā)表在ACS Applied Materials & Interfaces上。

相關(guān)產(chǎn)品
1、非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)—mIRage（生物領(lǐng)域）
2、超高分辨活細胞熒光紅外顯微成像系統(tǒng)