宏基因組學揭示豬糞與土壤中抗菌藥物抗性基因與金屬抗性基因的共存
抗菌藥物被廣泛用于治療人類和動物的感染性疾病，但其過度使用導致了抗菌藥物抗性（AMR）增加。細菌對幾乎所有類別的抗菌藥物都已表現(xiàn)出抗性，這引起了全球關(guān)注�？咕幬锟剐詫步】禈�(gòu)成全球性挑戰(zhàn)，而動物飼料中添加的鋅（Zn）、銅（Cu）等金屬和環(huán)境中金屬離子的存在可能通過共選擇機制促進抗菌藥物抗性的傳播。金屬污染可能作為選擇因子促進抗菌藥物抗性的傳播，尤其是在金屬和抗菌藥物負擔較高的環(huán)境中，抗菌藥物抗性基因（ARGs）和金屬抗性基因（MRGs）的共選擇已被證實。但共選擇程度尚未完全明確。
近日，江蘇省疾病預防控制中心彭世富博士為第一作者、丁震教授為通訊作者研究了豬糞便和施用污泥的農(nóng)業(yè)土壤中ARGs基因和MRGs基因的共存現(xiàn)象，以及這些抗性基因與可移動遺傳元件（MGEs）之間的關(guān)系。相關(guān)研究成果以《Co-occurrence of antimicrobial and metal resistance genes in pig feces and agricultural fields fertilized with slurry》為題發(fā)表于《Science of The Total Environment》期刊。
標題：Co-occurrence of antimicrobial and metal resistance genes in pig feces and agricultural fields fertilized with slurry（豬糞便和施肥農(nóng)田中抗菌和金屬抗性基因的共存）
發(fā)表期刊：Science of The Total Environment
影響因子： IF 8.2 / Q1
技術(shù)平臺：宏基因組測序
本研究采用宏基因組學方法對豬糞便、土壤和沉積物樣本中的抗菌藥物抗性基因（ARGs）、金屬抗性基因（MRGs）以及可移動遺傳元件（MGEs）進行分析，MGEs元件被認為是ARGs和MRGs傳播的潛在載體。同時研究檢測了金屬離子的濃度，以評估ARGs、MRGs與金屬濃度之間的相互關(guān)系。研究樣本包括來自中國養(yǎng)豬場的新鮮豬糞便、施用處理后污泥的土壤以及排放處理后污泥的水體沉積物。在所有三種樣本類型中，四環(huán)素抗性基因和鋅抗性基因是最常被檢測到的ARGs和MRGs。通過皮爾遜相關(guān)性分析表明，ARGs與MRGs的豐度之間、ARGs/MRGs與MGEs之間以及金屬與ARGs/MGEs之間存在顯著的相關(guān)性。進一步的網(wǎng)絡(luò)分析揭示了特定ARGs與MRGs之間、ARGs/MRGs與MGEs之間以及特定金屬（Zn、Cr和Mn）與ARGs和MGEs之間的顯著共存關(guān)系�？傮w而言，本研究結(jié)果表明，在養(yǎng)豬場的污泥及其周邊環(huán)境中，抗菌藥物抗性基因和金屬抗性基因存在高度共存現(xiàn)象。研究結(jié)果提示，飼料中添加的金屬可能促進了養(yǎng)豬生產(chǎn)環(huán)境中ARGs和MGEs的共選擇，從而導致可移動ARGs庫擴大。
研究摘要
研究方法
樣本采集：研究選擇了中國江蘇省的兩個有使用氧化鋅歷史的豬場，采集了新鮮豬糞便、施用處理后污泥的土壤和排放處理后污泥的水體沉積物樣本。
金屬和抗菌藥物殘留檢測：通過ICP-OES和HPLC-MS/MS技術(shù)檢測了樣本中的10種重金屬和15種獸用抗菌藥物的濃度。
宏基因組測序分析：提取樣本中的總基因組DNA進行宏基因組高通量測序，并對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、組裝和開放閱讀框（ORF）預測，并基于CARD、BacMet等數(shù)據(jù)庫對ARGs和MRGs進行注釋，同時分析了樣本中的MGEs。
研究結(jié)果
（1）糞便、沉積物和土壤中的微生物組特征
豬糞便樣本中的主要菌屬為鏈球菌、擬桿菌、梭菌等，而沉積物和土壤樣本中的優(yōu)勢菌屬分別為硫桿菌和 Bradyrhizobium。PCA分析顯示，三種樣本類型的微生物群落組成差異顯著。
圖1：新鮮糞便、沉積物和土壤中細菌群落的組成和多樣性。
（A）細菌群落中主要屬（平均相對豐度超過.1%）的分布。
（B）基于宏基因組的30個細菌群落的主成分分析（PCA）。不同顏色表示三種不同的棲息地狀態(tài)。
（C）α多樣性表明，與沉積物和土壤相比，新鮮糞便樣本中細菌的多樣性更高。
（D）β多樣性顯示，在相同類型的棲息地中，較低的值（由較淺的顏色表示）出現(xiàn)。FA1-5、SA1-5和SMA1-5分別對應A農(nóng)場的新鮮糞便、土壤和沉積物；同樣，F(xiàn)B1-5、SB1-5和SMB1-5分別對應B農(nóng)場的新鮮糞便、土壤和沉積物。
（2）新鮮糞便、沉積物和土壤中抗菌藥物及抗菌藥物抗性基因（ARGs）的分布情況
檢測到的抗菌藥物包括喹諾酮類、四環(huán)素類和簡單β-內(nèi)酰胺類。ARGs中，四環(huán)素抗性基因在所有樣本中占比最高，表明四環(huán)素的使用可能對ARGs的分布有顯著影響。
圖2:新鮮糞便、沉積物和土壤中抗菌藥物抗性基因（ARGs）和金屬抗性基因（MRGs）的分布特征。
（A）檢測到的ARGs的相對豐度，按其對應的抗菌藥物類別進行分類。
（B）ARGs的不同抗性機制。
（C）檢測到的MRGs的相對豐度，按其對應的重金屬及相關(guān)化合物分類。
（3）ARGs、MRGs、MGEs和金屬之間的共存模式
通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，鋅濃度與多藥抗性基因（如mdtB和yegN）在糞便中表現(xiàn)出共存關(guān)系，鉻與整合酶基因intI1共存，表明金屬可能通過共選擇機制促進ARGs和MGEs的傳播。
圖3：在新鮮糞便（A）、沉積物（B）和土壤（C）中，抗菌藥物抗性基因（ARGs）、金屬抗性基因（MRGs）、可移動遺傳元件（MGEs）和金屬之間的網(wǎng)絡(luò)分析。圖表特別繪制以突出顯示與不同金屬實際相關(guān)的ARGs、MGEs和MRGs。一條連接線表示極其強的（皮爾遜相關(guān)系數(shù)r＞0.9）且顯著（P＜0.001）相關(guān)性。不同顏色的節(jié)點分別代表抗菌藥物抗性基因（ARGs，紅色）、金屬抗性基因（MRGs，粉色）、可移動遺傳元件（MGEs，綠色）和金屬（藍色）。節(jié)點的大小與節(jié)點之間的連接數(shù)量成正比。藍色線條表示與金屬相關(guān)的因素。
易小結(jié)
本研究通過宏基因組學分析表明，在豬場及其周邊環(huán)境中，抗菌藥物抗性基因和金屬抗性基因存在高度共存現(xiàn)象。金屬的添加可能促進了ARGs和MGEs的共選擇，從而導致環(huán)境中可移動ARGs的增加。這一發(fā)現(xiàn)強調(diào)了金屬在抗菌藥物抗性傳播中的潛在作用，并提示需要關(guān)注動物飼料中金屬添加劑的使用。
宏基因組測序在本研究中的作用
全面分析抗性基因譜：宏基因組測序能夠全面檢測樣本中的ARGs和MRGs，揭示了不同生態(tài)系統(tǒng)中抗性基因的多樣性、豐度和分布特征。與傳統(tǒng)的qPCR等方法相比，宏基因組測序能夠提供更全面的抗性基因譜，包括尚未被注釋的新型抗性基因。
揭示微生物群落結(jié)構(gòu)：通過分析樣本中的微生物群落組成，宏基因組測序揭示了豬糞便、土壤和沉積物中微生物群落的差異，為理解抗性基因的宿主背景提供了重要信息。
探索基因共存模式：宏基因組測序數(shù)據(jù)支持了網(wǎng)絡(luò)分析，揭示了ARGs、MRGs和MGEs之間的共存關(guān)系，以及它們與金屬濃度的關(guān)聯(lián)。這種分析有助于理解抗性基因在環(huán)境中的傳播機制和共選擇機制。
提供定量和定性信息：宏基因組測序不僅能夠定性檢測抗性基因的存在，還能通過reads比對提供抗性基因的相對豐度信息，為評估抗性基因的環(huán)境風險提供了定量依據(jù)。
揭示潛在的水平基因轉(zhuǎn)移事件：通過檢測MGEs與ARGs和MRGs的共存關(guān)系，宏基因組測序為研究抗性基因的水平轉(zhuǎn)移提供了線索，有助于理解抗性基因在不同微生物之間的傳播路徑。
總之，宏基因組測序在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，為深入理解抗菌藥物抗性和金屬抗性基因的共存、共選擇機制以及它們在環(huán)境中的傳播提供了全面且深入的視角。
關(guān)于宏基因組學測序研究方案
由于擴增子測序技術(shù)關(guān)注的是目標基因的若干區(qū)域，因此其分辨率有限，一般認為較為準確的分類水平到屬級別。雖然擴增子測序也可以通過數(shù)據(jù)庫映射預測群落可能的功能網(wǎng)絡(luò)，但是微生物遺傳片段交流比較頻繁，功能基因的橫向轉(zhuǎn)移也較為普遍，依托于有限菌株建立的功能映射無法盡可能的還原群落的真實功能網(wǎng)絡(luò)。全宏基因組測序技術(shù)直接對提取的全宏基因組DNA建立隨機小片段文庫，能夠獲取更多的序列信息。通過組裝、ORFs預測與注釋，可以大大提高分類水平部分至菌株級別，并通過各種大型公共數(shù)據(jù)庫進行相應功能注釋，盡可能真實的獲取群落功能網(wǎng)絡(luò)信息。高精度的分析結(jié)果也使相關(guān)動物驗證實驗更加具備可行性。
技術(shù)優(yōu)勢：
參考文獻：
Peng S, Zheng H, Herrero-Fresno A, Olsen JE, Dalsgaard A, Ding Z. Co-occurrence of antimicrobial and metal resistance genes in pig feces and agricultural fields fertilized with slurry. Sci Total Environ. 2021 Oct 20;792:148259. pii: S0048-9697(21)03330-1. doi: 10.1016/j.scitotenv.2021.148259. PubMed PMID: 34147788.
近日，江蘇省疾病預防控制中心彭世富博士為第一作者、丁震教授為通訊作者研究了豬糞便和施用污泥的農(nóng)業(yè)土壤中ARGs基因和MRGs基因的共存現(xiàn)象，以及這些抗性基因與可移動遺傳元件（MGEs）之間的關(guān)系。相關(guān)研究成果以《Co-occurrence of antimicrobial and metal resistance genes in pig feces and agricultural fields fertilized with slurry》為題發(fā)表于《Science of The Total Environment》期刊。
標題：Co-occurrence of antimicrobial and metal resistance genes in pig feces and agricultural fields fertilized with slurry（豬糞便和施肥農(nóng)田中抗菌和金屬抗性基因的共存）
發(fā)表期刊：Science of The Total Environment
影響因子： IF 8.2 / Q1
技術(shù)平臺：宏基因組測序
本研究采用宏基因組學方法對豬糞便、土壤和沉積物樣本中的抗菌藥物抗性基因（ARGs）、金屬抗性基因（MRGs）以及可移動遺傳元件（MGEs）進行分析，MGEs元件被認為是ARGs和MRGs傳播的潛在載體。同時研究檢測了金屬離子的濃度，以評估ARGs、MRGs與金屬濃度之間的相互關(guān)系。研究樣本包括來自中國養(yǎng)豬場的新鮮豬糞便、施用處理后污泥的土壤以及排放處理后污泥的水體沉積物。在所有三種樣本類型中，四環(huán)素抗性基因和鋅抗性基因是最常被檢測到的ARGs和MRGs。通過皮爾遜相關(guān)性分析表明，ARGs與MRGs的豐度之間、ARGs/MRGs與MGEs之間以及金屬與ARGs/MGEs之間存在顯著的相關(guān)性。進一步的網(wǎng)絡(luò)分析揭示了特定ARGs與MRGs之間、ARGs/MRGs與MGEs之間以及特定金屬（Zn、Cr和Mn）與ARGs和MGEs之間的顯著共存關(guān)系�？傮w而言，本研究結(jié)果表明，在養(yǎng)豬場的污泥及其周邊環(huán)境中，抗菌藥物抗性基因和金屬抗性基因存在高度共存現(xiàn)象。研究結(jié)果提示，飼料中添加的金屬可能促進了養(yǎng)豬生產(chǎn)環(huán)境中ARGs和MGEs的共選擇，從而導致可移動ARGs庫擴大。
研究摘要
研究方法
樣本采集：研究選擇了中國江蘇省的兩個有使用氧化鋅歷史的豬場，采集了新鮮豬糞便、施用處理后污泥的土壤和排放處理后污泥的水體沉積物樣本。
金屬和抗菌藥物殘留檢測：通過ICP-OES和HPLC-MS/MS技術(shù)檢測了樣本中的10種重金屬和15種獸用抗菌藥物的濃度。
宏基因組測序分析：提取樣本中的總基因組DNA進行宏基因組高通量測序，并對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、組裝和開放閱讀框（ORF）預測，并基于CARD、BacMet等數(shù)據(jù)庫對ARGs和MRGs進行注釋，同時分析了樣本中的MGEs。
研究結(jié)果
（1）糞便、沉積物和土壤中的微生物組特征
豬糞便樣本中的主要菌屬為鏈球菌、擬桿菌、梭菌等，而沉積物和土壤樣本中的優(yōu)勢菌屬分別為硫桿菌和 Bradyrhizobium。PCA分析顯示，三種樣本類型的微生物群落組成差異顯著。
圖1：新鮮糞便、沉積物和土壤中細菌群落的組成和多樣性。
（B）基于宏基因組的30個細菌群落的主成分分析（PCA）。不同顏色表示三種不同的棲息地狀態(tài)。
（C）α多樣性表明，與沉積物和土壤相比，新鮮糞便樣本中細菌的多樣性更高。
（D）β多樣性顯示，在相同類型的棲息地中，較低的值（由較淺的顏色表示）出現(xiàn)。FA1-5、SA1-5和SMA1-5分別對應A農(nóng)場的新鮮糞便、土壤和沉積物；同樣，F(xiàn)B1-5、SB1-5和SMB1-5分別對應B農(nóng)場的新鮮糞便、土壤和沉積物。
（2）新鮮糞便、沉積物和土壤中抗菌藥物及抗菌藥物抗性基因（ARGs）的分布情況
檢測到的抗菌藥物包括喹諾酮類、四環(huán)素類和簡單β-內(nèi)酰胺類。ARGs中，四環(huán)素抗性基因在所有樣本中占比最高，表明四環(huán)素的使用可能對ARGs的分布有顯著影響。
（A）檢測到的ARGs的相對豐度，按其對應的抗菌藥物類別進行分類。
（B）ARGs的不同抗性機制。
（C）檢測到的MRGs的相對豐度，按其對應的重金屬及相關(guān)化合物分類。
（3）ARGs、MRGs、MGEs和金屬之間的共存模式
通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，鋅濃度與多藥抗性基因（如mdtB和yegN）在糞便中表現(xiàn)出共存關(guān)系，鉻與整合酶基因intI1共存，表明金屬可能通過共選擇機制促進ARGs和MGEs的傳播。
易小結(jié)
本研究通過宏基因組學分析表明，在豬場及其周邊環(huán)境中，抗菌藥物抗性基因和金屬抗性基因存在高度共存現(xiàn)象。金屬的添加可能促進了ARGs和MGEs的共選擇，從而導致環(huán)境中可移動ARGs的增加。這一發(fā)現(xiàn)強調(diào)了金屬在抗菌藥物抗性傳播中的潛在作用，并提示需要關(guān)注動物飼料中金屬添加劑的使用。
宏基因組測序在本研究中的作用
全面分析抗性基因譜：宏基因組測序能夠全面檢測樣本中的ARGs和MRGs，揭示了不同生態(tài)系統(tǒng)中抗性基因的多樣性、豐度和分布特征。與傳統(tǒng)的qPCR等方法相比，宏基因組測序能夠提供更全面的抗性基因譜，包括尚未被注釋的新型抗性基因。
揭示微生物群落結(jié)構(gòu)：通過分析樣本中的微生物群落組成，宏基因組測序揭示了豬糞便、土壤和沉積物中微生物群落的差異，為理解抗性基因的宿主背景提供了重要信息。
探索基因共存模式：宏基因組測序數(shù)據(jù)支持了網(wǎng)絡(luò)分析，揭示了ARGs、MRGs和MGEs之間的共存關(guān)系，以及它們與金屬濃度的關(guān)聯(lián)。這種分析有助于理解抗性基因在環(huán)境中的傳播機制和共選擇機制。
提供定量和定性信息：宏基因組測序不僅能夠定性檢測抗性基因的存在，還能通過reads比對提供抗性基因的相對豐度信息，為評估抗性基因的環(huán)境風險提供了定量依據(jù)。
揭示潛在的水平基因轉(zhuǎn)移事件：通過檢測MGEs與ARGs和MRGs的共存關(guān)系，宏基因組測序為研究抗性基因的水平轉(zhuǎn)移提供了線索，有助于理解抗性基因在不同微生物之間的傳播路徑。
總之，宏基因組測序在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，為深入理解抗菌藥物抗性和金屬抗性基因的共存、共選擇機制以及它們在環(huán)境中的傳播提供了全面且深入的視角。
關(guān)于宏基因組學測序研究方案
由于擴增子測序技術(shù)關(guān)注的是目標基因的若干區(qū)域，因此其分辨率有限，一般認為較為準確的分類水平到屬級別。雖然擴增子測序也可以通過數(shù)據(jù)庫映射預測群落可能的功能網(wǎng)絡(luò)，但是微生物遺傳片段交流比較頻繁，功能基因的橫向轉(zhuǎn)移也較為普遍，依托于有限菌株建立的功能映射無法盡可能的還原群落的真實功能網(wǎng)絡(luò)。全宏基因組測序技術(shù)直接對提取的全宏基因組DNA建立隨機小片段文庫，能夠獲取更多的序列信息。通過組裝、ORFs預測與注釋，可以大大提高分類水平部分至菌株級別，并通過各種大型公共數(shù)據(jù)庫進行相應功能注釋，盡可能真實的獲取群落功能網(wǎng)絡(luò)信息。高精度的分析結(jié)果也使相關(guān)動物驗證實驗更加具備可行性。
技術(shù)優(yōu)勢：
- 超深度視野： 提取的全宏基因組DNA建立隨機小片段文庫，避免了目的片段的PCR過程，降低bias，隨機測序，獲取更豐富的序列信息；
- 更精確分類定位： 最大限度地獲取全宏基因組序列信息，通過組裝延伸，可精確定位部分序列至分類學菌株水平；
- 真實可靠的功能分析： 不再是依托映射數(shù)據(jù)庫進行功能預測，而是通過測得的功能基因序列盡可能真實還原構(gòu)建微生態(tài)系統(tǒng)的功能網(wǎng)絡(luò)。
參考文獻：
Peng S, Zheng H, Herrero-Fresno A, Olsen JE, Dalsgaard A, Ding Z. Co-occurrence of antimicrobial and metal resistance genes in pig feces and agricultural fields fertilized with slurry. Sci Total Environ. 2021 Oct 20;792:148259. pii: S0048-9697(21)03330-1. doi: 10.1016/j.scitotenv.2021.148259. PubMed PMID: 34147788.
標簽：
宏基因組
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