InnoScan 文獻(xiàn)解讀：基于小分子微陣列篩選RNase P RNA抑制劑

 
引言
近年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)非編碼RNA（ncRNA）在細(xì)胞中扮演著重要角色。ncRNA的失調(diào)與癌癥、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病有關(guān)。因此，開發(fā)針對(duì)ncRNA的小分子藥物成為藥物研發(fā)的新方向。然而，RNA的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且多變，這使得它成為藥物靶點(diǎn)的難度較大。傳統(tǒng)的藥物篩選方法在RNA靶點(diǎn)上的應(yīng)用效果有限，而小分子微陣列（SMM）技術(shù)為RNA靶向藥物的發(fā)現(xiàn)提供了新的可能性。

來自俄亥俄州立大學(xué)等單位的研究人員利用小分子微陣列（SMM）技術(shù)，篩選并鑒定了Methanobrevibacter smithii（Msm）RNase P RNA（RPR）的抑制劑。RNase P是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的核酶，負(fù)責(zé)前體tRNA的5'端成熟。由于它在不同生物中的結(jié)構(gòu)多樣性和低拷貝數(shù)，RNase P成為潛在的藥物靶點(diǎn)。通過SMM篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)了多個(gè)能夠特異性結(jié)合Msm RPR的小分子，并進(jìn)一步驗(yàn)證了其中一種二芳基哌啶類化合物（M1）的抑制活性。

小分子微陣列（SMM）篩選技術(shù)
SMM技術(shù)是一種高通量篩選方法，能夠快速鑒定與目標(biāo)RNA結(jié)合的小分子。在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了Arrayjet公司的Robotic Microarray Printer（Arrayjet, Roslin, UK）來制備微陣列。該設(shè)備能夠?qū)?300種化合物精確打印在化學(xué)修飾的玻璃片上，形成高密度微陣列。此外，研究人員還使用了InnoScan 1100 AL熒光掃描儀（Innopsys, Carbonne, France）來檢測(cè)熒光信號(hào)。

具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
微陣列制備：使用Arrayjet公司的Robotic Microarray Printer將7300種化合物打印在載玻璃片上。
RNA標(biāo)記：Msm RPR通過5'端延伸的DNA寡核苷酸與Cy5熒光標(biāo)記的DNA寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，形成熒光標(biāo)記的Msm RPR。
篩選過程：將熒光標(biāo)記的Msm RPR與微陣列上的小分子孵育，使用InnoScan 1100 AL掃描儀進(jìn)行熒光成像，檢測(cè)小分子與RNA的結(jié)合情況。
數(shù)據(jù)分析：通過計(jì)算每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，篩選出與Msm RPR特異性結(jié)合的小分子。篩選標(biāo)準(zhǔn)包括信噪比（SNR）大于0、Z-score大于3、重復(fù)點(diǎn)的變異系數(shù)（CV）小于100等。
 
InnoScan 1100 AL熒光掃描儀在這項(xiàng)研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。它的高分辨率和靈敏度使得研究人員能夠準(zhǔn)確檢測(cè)微陣列上每個(gè)點(diǎn)的熒光信號(hào)，從而篩選出與Msm RPR結(jié)合的小分子。通過該儀器，研究人員在400 mM Mg²⁺條件下篩選出48個(gè)與Msm RPR特異性結(jié)合的小分子，命中率為0.7%（圖1C）。在10 mM Mg²⁺條件下，篩選出58個(gè)結(jié)合分子，命中率為0.8%。值得注意的是，兩種條件下僅有8個(gè)化合物重疊，表明不同Mg²⁺濃度下Msm RPR的構(gòu)象變化影響了小分子的結(jié)合。 （A） 帶有5'和3'延伸的Msm RPR的二級(jí)結(jié)構(gòu)（文中稱為Msm RPR）。在該圖中，P表示RPR中按轉(zhuǎn)錄順序標(biāo)記的配對(duì)區(qū)域，L表示環(huán)狀區(qū)域。使用與5'延伸互補(bǔ)的Cy5標(biāo)記的DNA寡核苷酸生成熒光標(biāo)記的Msm RPR，用于后續(xù)的SMM篩選。縮寫：PC，陽性對(duì)照；NC，陰性對(duì)照。
（B） Mg²⁺對(duì)Msm RPR前體tRNA加工活性的影響。變性聚丙烯酰胺凝膠[10%（w/v）/7 M尿素]顯示，在10 mM或400 mM Mg²⁺存在下，Msm RPR對(duì)5'-[32P]標(biāo)記的Thermus thermophilus（Tth）前體tRNA⁶ˡʸ的切割情況，反應(yīng)在37°C下進(jìn)行1小時(shí)。
（C） Z-score散點(diǎn)圖，比較在400 mM或10 mM Mg²⁺條件下的SMM篩選結(jié)果。藍(lán)色數(shù)據(jù)點(diǎn)表示在400 mM Mg²⁺條件下優(yōu)先結(jié)合的小分子。紅色虛線對(duì)應(yīng)Z-score值為3，Z-score大于3的小分子被認(rèn)為是選擇性結(jié)合物。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的小分子與Msm RPR的結(jié)合親和力，研究人員使用了Plexera公司的表面等離子體共振成像（SPRi）技術(shù)。SPRi技術(shù)是一種無標(biāo)記的光學(xué)傳感技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)分子間的相互作用。在這項(xiàng)研究中，研究人員將M1及其類似物固定在SPRi芯片上，通過流動(dòng)相中的Msm RPR與芯片上的小分子結(jié)合，檢測(cè)結(jié)合過程中的折射率變化，從而計(jì)算出結(jié)合親和力（K_D(app)）。

具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
芯片制備：使用Plexera公司的SPRi芯片，將M1及其類似物以8×8陣列格式打印在芯片表面。
結(jié)合實(shí)驗(yàn)：將折疊好的Msm RPR注入流動(dòng)池，進(jìn)行300秒的結(jié)合和300秒的解離過程，流速為2 μL/s。
數(shù)據(jù)分析：通過Plexera SPR Data Analysis軟件分析結(jié)合曲線，計(jì)算出M1及其類似物與Msm RPR的結(jié)合親和力。

通過SPRi技術(shù)，研究人員確定了M1與Msm RPR的結(jié)合親和力（K_D(app)）為8 ± 3 μM（圖3C, D），進(jìn)一步驗(yàn)證了M1的抑制活性。 （C） 用于測(cè)定M1syn與Msm RPR結(jié)合親和力的代表性表面等離子體共振成像（SPRI）傳感圖。將濃度遞增的Msm RPR（0.625–20 μM）流過M1syn固定的芯片，獲得SPRI傳感圖和相應(yīng)的結(jié)合曲線（D）三次獨(dú)立試驗(yàn)的數(shù)據(jù)用于計(jì)算報(bào)告的結(jié)合親和力（K_D(app)）值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
 
M1的抑制活性驗(yàn)證
在篩選出的48個(gè)結(jié)合分子中，研究人員進(jìn)一步驗(yàn)證了M1的抑制活性。M1是一種二芳基哌啶類化合物，具有較好的藥物特性，包括三個(gè)芳環(huán)、兩個(gè)氫鍵供體、一個(gè)氫鍵受體和401 Da的分子量。通過前體tRNA切割實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)M1能夠抑制Msm RPR的活性，抑制常數(shù)（Ki）為17 ± 1 μM。此外，SPRi實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了M1與Msm RPR的結(jié)合親和力（K_D(app)為8 ± 3 μM）。

結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR）分析
為了進(jìn)一步理解M1的抑制機(jī)制，研究人員合成了多個(gè)M1類似物，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系分析。結(jié)果表明，M1的核心結(jié)構(gòu)中的甲基和哌啶環(huán)上的氮原子對(duì)其抑制活性至關(guān)重要。例如，去除甲基（M1-desMe）導(dǎo)致結(jié)合親和力下降4-5倍，抑制活性下降6倍。此外，哌啶環(huán)上的氮原子修飾（如M1-desMe-N-allyl）進(jìn)一步降低了抑制活性。這些結(jié)果表明，M1的結(jié)構(gòu)特征與其抑制活性密切相關(guān)。

M1的選擇性分析
為了驗(yàn)證M1的選擇性，研究人員測(cè)試了M1及其類似物對(duì)另一種結(jié)構(gòu)相似的古菌RNase P RNA（Pfu RPR）的抑制效果。結(jié)果表明，M1及其類似物對(duì)Pfu RPR沒有明顯的抑制作用，進(jìn)一步證明了M1對(duì)Msm RPR的選擇性。這一選擇性可能與Msm RPR和Pfu RPR在結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異有關(guān)，尤其是Msm RPR的AU含量較高，可能形成了適合M1結(jié)合的構(gòu)象。

討論與展望
這項(xiàng)研究展示了SMM技術(shù)在RNA靶向藥物篩選中的應(yīng)用潛力。通過SMM篩選，研究人員成功鑒定了Msm RPR的特異性抑制劑M1，并通過結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系分析揭示了其抑制機(jī)制。M1的選擇性抑制為開發(fā)針對(duì)特定RNA靶點(diǎn)的小分子藥物提供了新的思路。

未來的研究方向包括進(jìn)一步優(yōu)化M1的結(jié)構(gòu)以提高其抑制活性，并探索其在減少牛瘤胃中甲烷排放中的應(yīng)用。此外，M1的類似物可能被用于開發(fā)針對(duì)人類RNase P RNA（H1 RNA）的抑制劑，H1 RNA的失調(diào)與非小細(xì)胞肺癌等多種疾病相關(guān)。通過SMM技術(shù)篩選出的RNA靶向小分子有望為這些疾病的治療提供新的藥物候選物。

文獻(xiàn)鏈接：
Sidharthan, V., et al., Use of a small molecule microarray screen to identify inhibitors of the catalytic RNA subunit of Methanobrevibacter smithii RNase P. Nucleic Acids Res, 2025. 53(1).