蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ) ：常見(jiàn)蛋白酶的結(jié)構(gòu)、來(lái)源及性質(zhì)

蛋白酶解是自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中的重要步驟。通常，長(zhǎng)度在7-35個(gè)氨基酸之間的多肽更加適合用于質(zhì)譜采集。過(guò)長(zhǎng)的肽段很難采集到較好的質(zhì)譜譜圖，甚至可能在樣品制備過(guò)程中就與固相萃取吸附劑結(jié)合而丟失。過(guò)短的肽段由于與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有蛋白的隨機(jī)匹配度較高產(chǎn)生較大的假陽(yáng)性，意義也不大。因此，需要根據(jù)樣本特點(diǎn)和研究需求，選擇合適的蛋白酶進(jìn)行酶切，必要時(shí)，可結(jié)合幾種不同的酶使用。

蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的一些蛋白酶見(jiàn)表1，此部分內(nèi)容參考Jesse G. Meyer等^[1]的最新綜述整理。酶的選擇主要取決于應(yīng)用場(chǎng)景。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)組定性定量，通常僅使用trypsin即可。然而，對(duì)于未知序列的蛋白，則必須借助多酶聯(lián)合酶切的方式，通過(guò)從頭測(cè)序技術(shù)完成蛋白序列的組裝^[2-6]。
Trypsin
胰蛋白酶（trypsin），特異性強(qiáng)、效率高、成本低、適用性廣，是蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的酶^[7]。胰蛋白酶通常在堿性氨基酸Arg和Lys的C末端切割，但如果后面緊鄰脯氨酸（R/KP）則一般不切。胰蛋白酶產(chǎn)生的多肽長(zhǎng)度、疏水性均非常適合色譜分離、MS的碎裂和采集，譜圖易于進(jìn)行序列鑒定。盡管如此，理論上胰酶也只能覆蓋從基因組預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)組的一小部分。對(duì)于R和K密集切相鄰較近的蛋白，會(huì)產(chǎn)生大量短肽，而在缺乏R/K的蛋白質(zhì)區(qū)域中，會(huì)產(chǎn)生過(guò)長(zhǎng)的肽段。
  Lys-C參與切割賴氨酸的羧基末端。與trypsin一樣，其活性所需的最佳pH范圍是7-9。Lys-C的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是在變性劑體系中（如8M尿素）也可以保持活性。trypsin切割Lys的效率低于Arg，因此，為了蛋白水解更加充分，減少漏切，Lys-C通常與trypsin同時(shí)使用。

α-lytic
基于酵母蛋白質(zhì)組的水解多肽分布發(fā)現(xiàn)，α-裂解蛋白酶（ALP）的野生型（WALP）對(duì)丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸等較小的脂肪族氨基酸具有顯著特異性，此外對(duì)蘇氨酸和絲氨酸也有一定的特異性。突變型（MALP）對(duì)蛋氨酸、苯丙氨酸等稍大的氨基酸具有特異性，值得注意的是，相較于異亮氨酸，對(duì)亮氨酸更有偏向性。

Glu-C
Glu-C（也稱V8）蛋白酶，是一種從金黃色葡萄球菌223獲得的絲氨酸蛋白酶，在谷氨酸和天冬氨酸的C端切割。

Asp-N
Asp-N催化天冬氨酸殘基N端肽鍵的水解。該酶的最佳反應(yīng)pH值介于4-9之間。由于它屬于金屬蛋白酶，使用Asp-N時(shí)應(yīng)避免使用螯合劑（如EDTA）作為緩沖液。研究還表明，當(dāng)?shù)鞍姿�解緩沖液中存在表面活性劑時(shí)，Asp-N會(huì)在谷氨酸的氨基末端切割^[8]。Asp-N 的漏切比較多^[9]。

Chymotrypsin
Chymoreypsin在疏水性氨基酸 Phe、Trp、Tyr和Met和Leu 殘基的C端進(jìn)行切割。由于膜蛋白的跨膜區(qū)通常缺乏trypsin切割位點(diǎn)，因此該酶可與具有更多疏水性殘基的膜蛋白配合試用^[9-11]。

Arg-C
Arg-C是主要水解C端Arg殘基，少量水解Lys殘基，產(chǎn)生的肽通常比trypsin更長(zhǎng)。Arg-C經(jīng)常與其他蛋白酶一起使用，以改進(jìn)定性蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)并用于研究翻譯后修飾^[12]。

Ulilysin
Ulilysin（即LysargiNase）可以視作trypsin的鏡像酶，可特異性地切割Lys和Arg殘基的N端。因此，它能夠發(fā)現(xiàn)使用trypsin無(wú)法觀察到的C端多肽。此外，它還可以切割修飾氨基酸，例如甲基化或二甲基化的Arg和Lys^[13]。

Lys-N
Lys-N切割Lys的N端，在pH=9.0時(shí)活性最高。與trypsin不同，Lys-N對(duì)變性劑的抵抗力更強(qiáng)，在70°C時(shí)仍保持穩(wěn)定。由Lys-N消化產(chǎn)生的肽使用 ETD 碎裂產(chǎn)生更多的c離子^[14]。因此，可用于分析PTM、識(shí)別C端多肽以及從頭測(cè)序^[14-15]。

Pepsin
Pepsin即胃蛋白酶，最佳pH范圍為1-4，可特異性裂解色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和亮氨酸（Leu）^[12]。由于它在較低pH下具有高酶活性和廣泛特異性，因此它比其他蛋白酶更適合用于基于MS的二硫化物分析^[16-17]。Pepsin還廣泛用于氫-氘交換 ( HDX ) 的結(jié)構(gòu)質(zhì)譜研究，因?yàn)樵诘蚿H值下酰胺氘的回交換速率最小^[18-19]。

Proteinase K
Proteinase K因?qū)�角蛋白（keratin）有較強(qiáng)的水解能力而得名[20]，偏好在疏水性和芳香基氨基酸殘基處進(jìn)行切割^[21]，沒(méi)有顯著的氨基酸特異性，最佳酶活性在pH 7.5-12之間。 低濃度的Proteinase K可用于限制性蛋白酶切-質(zhì)譜技術(shù)（LiP-MS）檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。

Tips：PEAKS^®內(nèi)置多種常見(jiàn)蛋白酶信息，且支持用戶自定義酶，在同一個(gè)分析中，兼容單一酶切數(shù)據(jù)和多酶聯(lián)合酶切數(shù)據(jù)類型。

參考文獻(xiàn)
1. Yuming J., Devasahayam A., Dina S., Jesse G. M. et al. Comprehensive Overview of Bottom-Up Proteomics Using Mass Spectrometry. ACS Measurement Science Au, 2024,4(4), 338-417. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsmeasuresciau.3c00068 

2. Blank-Landeshammer, B.; Teichert, I.; Märker, R.; Nowrousian, M.; Kück, U.; Sickmann, A. Combination of Proteogenomics with Peptide. mBio 2019, 10 (5). https://doi.org/10.1128/mbio.02367-19
3. Yang, H.; Li, Y.-C.; Zhao, M.-Z.; Wu, F.-L.; Wang, X.; Xiao, W.-D.; Wang, Y.-H.; Zhang, J.-L.; Wang, F.-Q.; Xu, F.; Zeng, W.-F.; Overall, C. M.; He, S.-M.; Chi, H.; Xu, P. Precision. Mol Cell Proteomics 2019, 18 (4), 773–785. https://doi.org/10.1074/mcp.tir118.000918.
4.Vanuopadath, M.; Sajeev, N.; Murali, A. R.; Sudish, N.; Kangosseri, N.; Sebastian, I. R.; Jain, N. D.; Pal, A.; Raveendran, D.; Nair, B. G.; Nair, S. S. Mass Spectrometry-Assisted Venom Profiling of Hypnale Hypnale Found in the Western Ghats of India Incorporating de Novo Sequencing Approaches. Int J Biol Macromol 2018, 118 (Pt B), 1736–1746. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.07.016.
5.Vanuopadath, M.; Raveendran, D.; Nair, B. G.; Nair, S. S. Venomics and Antivenomics of Indian Spectacled Cobra (Naja Naja) from the Western Ghats. Acta Tropica 2022, 228, 106324. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2022.106324.
6.Guthals, A.; Clauser, K. R.; Frank, A. M.; Bandeira, N. Sequencing-Grade De Novo Analysis of MS/MS Triplets (CID/HCD/ETD) From Overlapping Peptides. J. Proteome Res. 2013, 12 (6), 2846–2857. https://doi.org/10.1021/pr400173d.
7. Vandermarliere, E.; Mueller, M.; Martens, L. Getting Intimate with Trypsin, the Leading Protease in Proteomics. Mass Spec Rev 2013, 32 (6), 453–465. https://doi.org/10.1002/mas.21376.
8.Ingrosso, D.; Fowler, A. V.; Bleibaum, J.; Clarke, S. Specificity of Endoproteinase Asp-N (Pseudomonas Fragi): Cleavage at Glutamyl Residues in Two Proteins. Biochem Biophys Res Commun 1989, 162 (3), 1528–1534. https://doi.org/10.1016/0006-291x(89)90848-6.
9.Giansanti, P.; Tsiatsiani, L.; Low, T. Y.; Heck, A. J. R. Six Alternative Proteases for Mass Spectrometry-Based Proteomics Beyond Trypsin. Nat Protoc 2016, 11 (5), 993–1006. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.057.
10.Wilhelm, M.; Schlegl, J.; Hahne, H.; Gholami, A. M.; Lieberenz, M.; Savitski, M. M.; Ziegler, E.; Butzmann, L.; Gessulat, S.; Marx, H.; Mathieson, T.; Lemeer, S.; Schnatbaum, K.; Reimer, U.; Wenschuh, H.; Mollenhauer, M.; Slotta-Huspenina, J.; Boese, J.-H.; Bantscheff, M.; Gerstmair, A.; Faerber, F.; Kuster, B. Mass-Spectrometry-Based Draft of the Human Proteome. Nature 2014, 509 (7502), 582–587. https://doi.org/10.1038/nature13319.
11.Guo, X.; Trudgian, D. C.; Lemoff, A.; Yadavalli, S.; Mirzaei, H. Confetti: A Multiprotease Map of the HeLa Proteome for Comprehensive Proteomics. Mol Cell Proteomics 2014, 13 (6), 1573–1584. https://doi.org/10.1074/mcp.m113.035170.
12. Tsiatsiani, L.; Heck, A. J. R. Proteomics Beyond Trypsin. FEBS J 2015, 282 (14), 2612–2626. https://doi.org/10.1111/febs.13287.
13.Huesgen, P. F.; Lange, P. F.; Rogers, L. D.; Solis, N.; Eckhard, U.; Kleifeld, O.; Goulas, T.; Gomis-Rüth, F. X.; Overall, C. M. LysargiNase Mirrors Trypsin for Protein C-Terminal and Methylation-Site Identification. Nat Methods 2014, 12 (1), 55–58. https://doi.org/10.1038/nmeth.3177.
14.Taouatas, N.; Drugan, M. M.; Heck, A. J. R.; Mohammed, S. Straightforward Ladder Sequencing of Peptides Using a Lys-N Metalloendopeptidase. Nat Methods 2008, 5 (5), 405–407. https://doi.org/10.1038/nmeth.1204.
15.Raijmakers, R.; Neerincx, P.; Mohammed, S.; Heck, A. J. R. Cleavage Specificities of the Brother and Sister Proteases Lys-C and Lys-N. Chem Commun (Camb) 2010, 46 (46), 8827–8829. https://doi.org/10.1039/c0cc02523b.
16. Gorman, J. J.; Wallis, T. P.; Pitt, J. J. Protein Disulfide Bond Determination by Mass Spectrometry. Mass Spectrom Rev 2002, 21 (3), 183–216. https://doi.org/10.1002/mas.10025.
17. Liu, F.; van Breukelen, B.; Heck, A. J. R. Facilitating Protein Disulfide Mapping by a Combination of Pepsin Digestion, Electron Transfer Higher Energy Dissociation (EThcD), and a Dedicated Search Algorithm SlinkS. Mol Cell Proteomics 2014, 13 (10), 2776–2786. https://doi.org/10.1074/mcp.o114.039057.
18.Jones, L. M.; Zhang, H.; Vidavsky, I.; Gross, M. L. Online, High-Pressure Digestion System for Protein Characterization by Hydrogen/Deuterium Exchange and Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2010, 82 (4), 1171–1174. https://doi.org/10.1021/ac902477u.
19.Kostyukevich, Y.; Acter, T.; Zherebker, A.; Ahmed, A.; Kim, S.; Nikolaev, E. Hydrogen/Deuterium Exchange in Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews 2018, 37 (6), 811–853. https://doi.org/10.1002/mas.21565.
20.Ebeling, W.; Hennrich, N.; Klockow, M.; Metz, H.; Orth, H. D.; Lang, H. Proteinase K from Tritirachium Album Limber. Eur J Biochem 1974, 47 (1), 91–97. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1974.tb03671.x.
21. Saenger, W. Proteinase K. In Handbook of Proteolytic Enzymes; Elsevier, 2013; pp 3240–3242. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/b978-0-12-382219-2.00714-6.
 

作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過(guò)基于AI的計(jì)算方案，為您提供對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見(jiàn)。旗下著名的PEAKS^®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS^®️ Studio，PEAKS^®️ Online，PEAKS^®️ GlycanFinder, PEAKS^®️ AB，DeepImmu^®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。